神经酸对帕金森病小鼠运动障碍的改善及保护作用

胡丹东，崔玉娟，张 继

(1.北京市延庆区食品药品安全监控中心，北京 102100；2.西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州 730070；3.北京市延庆区疾病预防控制中心，北京 102100)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，全世界约有3%的60岁以上老人患有PD，随着人口老龄化人数的不断增加，其发病率呈大幅增长趋势。PD的典型症状，包括肌肉僵硬、运动迟缓、震颤和姿势不稳等运动障碍，还有感觉、情绪、认知和自主神经缺陷等多种非运动性症状[1-2]。大量研究表明，PD的基本病理特征是纹状体和黑质致密部多巴胺神经元的丢失、减少和路易小体在神经元内的积聚，这些因素综合作用可能是导致运动障碍症状的原因。多巴胺(DA)、酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)和α-突触核蛋白(α-synuclein)等分子被作为PD的标志物大量研究。目前，在携带α-synuclein基因特异性点突变的PD患者中，5-羟色胺(5-HT)的浓度水平被认为是PD的一个新标志物[3]。

神经酸(nervonic acid，NA)最初发现于哺乳动物的脑部神经组织中，因此命名为神经酸。NA是神经细胞维持生命活动不可缺少的核心成分，是修复受损神经的特效物质，据报道NA与大脑发育有关，可以减轻各种神经系统疾病[4]；NA缺乏可能会促进前驱症状患者向精神病的转化[5]；血浆神经酸水平升高是重性抑郁障碍、双相情感障碍和精神分裂症患者的一种常见趋势[6]；神经酸鞘脂和神经酸合成酶的年龄依赖性积聚，表明这些因素对正常和病理性脑老化有潜在影响[7]。因此，NA可能具有较好的神经保护作用。

目前，NA通过保护神经元改善PD运动障碍的报到较少，特别是对NA保护作用机制的系统研究更是少有报道。本研究通过构建PD小鼠模型，确定了NA对MPTP诱导的小鼠PD是否具有神经保护作用，揭示NA可通过提高纹状体DA、5-HT和TH、DAT的水平，抑制炎性因子表达，降低α-synuclein的表达和氧化应激来减轻运动障碍，从而为PD治疗提供新的候选药物。

1 材料

1.1 主要试剂和仪器神经酸(NA)(恒科生物科技股份有限公司，批号：ZC-21199-500 mg，含量90%，上海)；MPTP(Sigma，批号：M0896-100 mg，美国)；ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：E-EL-M0038c，武汉)；RNA提取试剂盒(碧云天生物技术研究所，批号：R0039-1 mg，上海)；BCA蛋白试剂盒(Sigma，批号：BCA1-1KT，美国)；ECL试剂盒(Thermo，批号：32132-100 mL，美国)；抗体(Abcam，英国)；SOD、GSH、MDA试剂盒(南京市建城生物工程研究所，SOD批号：a006-2-1 96T、GSH批号：a006-1-1 96T、MAD批号：a003-3-1 96T，南京)。

高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司，Agilent 1200s，美国)；电化学分析池(赛默飞世尔科技有限公司，CoulArray 5600A，美国)；酶标仪(美国热电公司，MK3，美国)；实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司，ABI 7500，美国)。

1.2 实验动物分组雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄，20-22 g)购自北京实验动物研究中心，饲养在标准动物房内，可自由获得食物和水。动物实验完全按照美国国立卫生研究院的指导方针进行，所有动物的治疗和行为测试均在光周期中进行。为确定NA的作用，将40只小鼠随机分为5组(n=8)，包括对照组、模型组、低剂量组(20 mg·kg-1-NA)、中剂量组(40 mg·kg-1-NA)和高剂量组(60 mg·kg-1-NA)，除对照组外，其余各组小鼠均给予MPTP(20 mg·kg-1溶于PBS中，腹腔注射)3 d诱导实验性PD模型。然后灌胃处理不同浓度的NA，对照组和模型组给予等量生理盐水，14 d后进行进一步的研究[8]。

2 方法

2.1 行为学测试

2.1.1爬杆试验 该实验评价NA对小鼠运动协调的影响。实验前至少1 h，让小鼠适应环境。笼子内固定一根直径9 mm、长度1 m的木杆，小鼠被放在木杆的顶端，记录下降到地面的时间[9-10]。

2.1.2滚轮实验 该实验评价NA对小鼠运动平衡的影响。实验前至少1 h，让小鼠适应环境，然后将小鼠放在加速杆上(4-40 r·min-1，最多5 min)，记录第一次跌倒的时间[9-10]。

2.1.3旷场试验 该实验评价NA对小鼠自主、探究行为能力的影响。实验前至少1 h，让小鼠适应环境。在每次实验中，将动物轻轻地放在方形木箱(60 cm×60 cm)的中心区域。使用Digiscan监视器(Omnitech Electronics)记录运动和行为，每隔10 min记录一次数据。在下一次试验之前，用乙醇溶液擦拭木箱并干燥[11]。

2.2 高效液相色谱分析收集纹状体的匀浆，在4 ℃下3 000 r·min-1离心15 min，收集上清液，使用HPLC和电化学检测分析纹状体多巴胺(DA)、5-HT和相关代谢物3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)和5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)的浓度。对于DA和5-HT的检测，使用流动相为[75 mmol·L-1乙酸钠、15 μmol·L-1EDTA(pH 6.0)、16%甲醇、3 mmol·L-1十二烷基硫酸钠和16%乙腈]；对于代谢物的检测，使用流动相为[100 mmol·L-1KH2PO4、10 mmol·L-1庚烷磺酸钠、150 μmol·L-1EDTA(pH 3.9)、5%甲醇和5%乙腈]；用C18反相柱(Agilent Technologies)，流动相流速为0.5 mL·min-1，柱温37 ℃，通过电化学分析池进行定量，所有数据均使用CoulArray 3.10版软件进行分析。

2.3 ELISA检测收集纹状体的匀浆，在4 ℃下3 000 r·min-1离心15 min，收集上清液，分析炎性细胞因子释放情况。用ELISA法检测血清样本中的IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平。

2.4 qRT-PCR用TRIzol法从纹状体组织中提取总RNA，用TaqMan一步法将RNA反转录成cDNA。通过实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR实验。用2-ΔΔCt法计算IL-1β、IL-6、TNF-α的相对mRNA表达水平，以GAPDH为内标，特异性引物序列如下：IL-1β正向引物5′-TAACCTGCTGGTGTGTGACGTTCC-3′，IL-1β反向引物5′-TCTTCTTCTTTGGGTATTGCTTGG-3′；IL-6正向引物5′-GAGACTTCCATCCAGTTGCCTTC-3′, IL-6反向引物5′-GATTGTTTTCTGCAAGTGCATCA-3′；TNF-α正向引物5′-TGAGCACAGAAAGCATGATC-3′，TNF-α反向引物5′-CATCTGCTGGTACCACCAGTT-3′；IL-10正向引物5′-AGTGGAGCAGGTGAAGAATG-3′，IL-10反向引物5′-CCAGCCTTAGGATCGAAGTT-3′；GAPDH正向引物5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTG-3′，GAPDH正向引物5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTTC-3′。

反应体系为：2×SYBR®Green Realtime PCR预混液12.5 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模版2 μL，加ddH2O至25 μL。循环为：95 ℃变性5 min；95 ℃持续15 s、55 ℃持续15 s、72 ℃持续10 s，进行40个循环；72 ℃延伸5 min。

2.5 Western blot分析分离小鼠纹状体，然后用含有1% PMSF和1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解组织。通过BCA蛋白试剂盒检测总蛋白的蛋白浓度。用10% SDS-PAGE将每个样品中等量的蛋白质装载并分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5%脱脂乳溶液封闭1 h后，将膜与一级抗体在4 ℃下孵育过夜。随后洗涤膜并与二级抗体(抗小鼠IgG或抗兔IgG，1 ∶10 000)在室温下孵育2 h。最后，使用ECL试剂盒对膜进行成像，并使用ImageJ软件进行定量。

2.6 SOD、GSH和MDA的定量分析将小鼠麻醉，取出大脑，用PBS清洗几次，立即分离纹状体，并用50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.4(1/10，W/V)均质。然后将匀浆10 000 r·min-1离心10 min，用试剂盒检测SOD、GSH和MDA活性水平。

3 结果

3.1 神经酸对PD小鼠行为缺陷的改善采用爬杆试验、滚轮试验和旷场试验对小鼠运动行为进行监测，以检测NA对小鼠运动功能的影响。在爬杆实验中，PD小鼠爬杆时间明显延长，模型组为(33.6±2.59)s，对照组为(6.85±1.32)s(P<0.01)，而经过NA处理组小鼠爬行时间明显缩短，且呈剂量依赖性(P<0.01)。通过滚轮实验评价了NA对PD小鼠运动平衡行为缺陷的影响，与对照组相比，MPTP诱发PD模型的平均滚动时间缩短了57%，相反在NA处理后各组都延长了滚轮时间(P<0.05)。在旷场实验评价自主、探究行为能力的影响方面，PD小鼠自主活动次数明显减少，模型组为(69.23±6.43)r·min-1，对照组为(98.36±10.83)r·min-1，与此相反NA给药后显示出神经保护作用，小鼠表现出比模型组更多的自发运动，自发运动次数由(77.68±7.63)r·min-1增加到(89.38±9.34)r·min-1，但仅中、高剂量NA组与模型组比较差异有显著性(P<0.05)，低剂量NA组与模型组比较差异并不明显。

3.2 神经酸对纹状体DA、5-HT及其代谢物水平的影响为了研究NA是否能防止多巴胺系统的退化，用HPLC法测定了纹状体中多巴胺(DA)及其相关代谢产物二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)，5-羟色胺(5-HT)及其相关代谢物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的浓度。如Fig 1A所示，MPTP处理后显著降低了纹状体DA和相关代谢物DOPAC、HVA的浓度水平，DA水平较对照组降低5倍(P<0.05)，与模型组相比，中剂量(40 mg·kg-1)和高剂量(60 mg·kg-1)NA处理使DA及相关代谢物的平均浓度明显升高。如Fig 1B所示，纹状体5-HT和相关代谢物5-HIAA的趋势一致，模型组5-HT和5-HIAA水平较对照组分别降低70.2%和71.4%，通过NA处理，5-HT和5-HIAA的水平以剂量依赖性的方式恢复。结果表明，NA能阻止PD模型中DA和5-HT的丢失。

Fig 1 Effect of NA on concentration of DA, 5-HT and its metabolites in

3.3 神经酸对纹状体TH、DAT蛋白表达的影响为揭示NA对纹状体中的TH的影响，通过Western blot分析监测TH表达变化水平。如Fig 2所示，在MPTP诱导的小鼠模型中观察到TH显著减少，但是通过中剂量和高剂量NA处理明显提高了TH蛋白的表达水平(P<0.01)，而低剂量NA处理则使TH蛋白表达轻度上调(P<0.05)。为了确定NA是否对DAT蛋白的表达水平有影响，同时检测了纹状体中DAT蛋白的表达的变化，如Fig 2B所示，DAT与TH蛋白表达变化趋势相同。结果表明，NA对多巴胺系统有保护作用，这与行为学运动障碍的改善及DA、5-HT代谢水平变化的结果一致。

Tab 1 Effect of NA on motor function of PD

Fig 2 Effect of NA on expression of TH and DAT protein in

3.4 神经酸对纹状体内炎症反应的影响如Fig 3A所示，与对照组相比，MTPT诱导的PD小鼠的纹状体中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的表达有明显上升；与模型组相比，经NA处理后各浓度组均能抑制炎性因子的表达水平，并且呈剂量依赖性(P<0.05)，但是低剂量差异并不明显。进一步通过qRT-PCR测定炎性因子的mRNA表达水平，与ELISA检测结果相似，与模型组相比降低了炎症因子的表达水平(P<0.05)。

Fig 3 Effect of NA on inflammation of

3.5 神经酸对α-突触核蛋白的表达及氧化应激反应的影响如Fig 4A所示，MPTP处理明显上调纹状体中α-突触核蛋白的表达，而NA以剂量依赖性方式降低α-突触核蛋白的表达(P<0.05)。考虑到氧化应激的增加可引起α-突触核蛋白的聚集，检测了小鼠纹状体中抗氧化标记物SOD和GSH的活性水平，以及MDA的含量变化。如Fig 4B所示，与对照组相比，MPTP组小鼠纹状体SOD和GSH活性降低，模型组SOD和GSH活性分别下降约70%和65%；而NA能明显提高SOD活性，同样NA处理也明显提高了PD小鼠模型中GSH的水平。如Fig 4C所示，与对照组相比，MDA的含量增加3倍，经过NA处理后，各组均明显降低了MDA的含量。

Fig 4 Effect of NA on expression of α-synuclein protein and oxidation stress

4 讨论

MPTP作为一种神经毒性污染物，被广泛应用于啮齿类动物的PD病理诱导，这种神经毒素可以通过血脑屏障，进一步转化为毒性形式-1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)，并转移到多巴胺神经元，导致多巴胺神经元的丢失或抑制线粒体功能[12]。大量研究表明，MPTP给药后动物都有多巴胺系统退化、氧化应激反应、线粒体功能障碍和炎症反应等PD症状产生[13]。因此，本研究构建了由MPTP诱导的PD小鼠模型，在研究过程中，与对照组相比，MPTP处理后，爬升时间显著增加，而平均滚动时间显著减少，同样实验组小鼠在开放区域的自发活动也较少，与PD具有很高的相似性；同时，在模型中除了纹状体DA、TH、DAT的下调外，α-突触核蛋白的高水平和氧化应激的激活也得出了相同的结果趋势；此外，模型中的炎症因子水平也有显著升高。综上所述，本研究成功地建立了PD小鼠运动障碍模型。

近年来，许多基于食物或植物的天然产物作为药物治疗的补充策略被用于治疗PD[14]，虫草素通过抑制MAPK信号通路的激活对PD小鼠神经元起保护作用[15]，醉茄素类化合物也被用于神经系统疾病的治疗[16]。NA在一些植物的果实和种子油中含量较高，其功效也引起了国内外相关学者的关注。大量对神经酸的研究发现，NA具有能够促进脑部发育、提高脑神经活跃程度、提高记忆力、防止脑神经衰老等作用。本研究着重研究了NA对帕金森的保护作用机制。首先，NA对MPTP诱导的运动障碍有部分保护作用，并在PD模型中表现出神经保护作用；其次，鉴于DA、5-HT、TH、DAT和α-突触核蛋白是PD的标志物，进一步研究了NA对这些分子的影响，在MPTP诱导后给予NA处理可避免纹状体DA、5-HT及其代谢物含量的降低，促进多巴胺神经元活性标记酶TH、DAT的蛋白表达，抑制纹状体α-突触核蛋白的表达；此外，NA的处理抑制了纹状体中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的表达。研究也进一步证实了NA参与氧化应激反应与α-突触核蛋白的丢失有关，通过上调PD小鼠模型SOD和GSH活性、降低MDA浓度，揭示了NA可能具有抗氧化作用。本研究结果表明，NA作为植物提取物是治疗PD的安全药物，为PD的治疗提供了新思路。

综上所述，NA通过调节多巴胺系统、提高标志蛋白表达、抑制炎症因子表达和抑制氧化应激，对PD神经元起保护作用，从而改善PD小鼠的运动障碍。