甘木通活性化合物的抗氧化活性及对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用

梁 璐，蔡晓彤，岑慧裕，徐文艳，洪 超，谭 霖，余细勇

(广州医科大学药学院，第五附属医院分子靶点与临床药理学重点实验室，呼吸道疾病国家重点实验室，广东 广州 511436)

心血管疾病目前死亡率是排名第一，严重威胁着人类健康[1-2]。心血管疾病发生机制非常复杂，心肌细胞损伤是各种心血管疾病的病理生理学基础[3]。心肌细胞的凋亡可能由氧化应激导致，进一步损伤心肌细胞的正常生理功能，最终导致心力衰竭等心血管疾病的发生[3]。抗氧化剂发挥抗氧化作用包括直接途径和间接途径，前者是通过抗氧化剂提供氢或电子，对自由基、活性氧和活性氮等起到直接抑制作用；而间接途径涉及通过诱导II期解毒和抗氧化酶的高表达来提供对氧化应激的防御[4]。因此，临床上应更加关注氧化应激在心脏损伤中的发病机制，开发更多抗氧化剂的治疗干预手段。

由于天然抗氧化剂的高安全性，植物抗氧化剂的研究引起了人们的广泛关注[5]。本研究所选植物甘木通含有珍贵的木脂素和黄酮类化合物，具有多种药理作用。甘木通(ClematisfilamentosaDunn.)是毛莨科丝铁线莲属植物，在我国广东、广西、海南、云南等地均有分布，其对多种心血管疾病有较好的治疗效果。然而，甘木通中药理活性成分尚不清楚，目前缺乏从甘木通中分离提取的单体化合物对心血管系统疾病的研究。本研究通过分离纯化甘木通提取物，得到木犀草素、咖啡酸、落叶松树脂醇、脲醛苷、二氢脱氢双烟酰基醇、芹菜素、黄芩苷、蒙花苷、齐墩果酸和鼠尾草素，化学结构如Fig 1所示。H2O2是一种性质稳定的细胞损伤模型的诱导剂，易于穿透细胞膜进入胞内，H2O2诱导心肌细胞氧化损伤是目前实验室常用的一种心肌细胞损伤造模方法[6]，能较好地模拟体内细胞损伤过程[7]。本研究以大鼠H9C2细胞为研究对象，探讨甘木通中10种化合物的抗氧化活性及其对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用，旨在为甘木通活性化合物的临床应用及心肌细胞损伤的药理作用研究提供参考依据。

Fig 1 The chemical structures of isolated compounds from Clematis filamentosa Dunn.

1 材料与方法

1.1 植物材料甘木通采集于中国省云南永寿区，由云南大学中国传统医学李国栋教授鉴定。

1.2 实验仪器低温高速离心机(德国Hettich 公司)；垂直电泳槽、转膜仪(美国Bio-Rad公司)；净工作台(苏州仪器厂)；CO2培养箱(Thermo)；-80 ℃冰箱(Thermo Fisher Scientific Inc)；酶标仪(美国加利福尼亚州森尼维尔市分子设备公司)；Agilent StrataGene Mx3000P QPCR(Agilent Technolo-gies)；流式细胞仪(Becton Dickinson-Facsort)。

1.3 实验试剂DMEM培养基(货号：12491-015)、胎牛血清(货号：10099)购于美国Gibco公司；胰蛋白酶(货号：T2601)、青-链霉素溶液(货号：ZS507)、MTT(货号：M2128)、DMSO(货号：D2650)购自美国 Sigma 公司；GAPDH 抗体(货号：TA-08)、抗兔二抗(货号：ZDR-5118)、抗鼠二抗(货号：ZDR-5117)购自北京中杉金桥；anti-caspase-3抗体(货号：AB13847)、anti-HO-1 抗体(货号：AB13248)、anti-β-actin抗体(货号：AB8227)购自Abcam公司；Lipofectamine 2000(货号：11668027)、TRIzol(货号：10296010)购自美国Invitrogen公司；荧光素酶报告试剂盒(货号：KA3714)购自美国Promege 公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(货号：C1067S)购自碧云天生物公司，Quantitect逆转录试剂盒(货号：204145)购自德国Qiagen公司。

1.4 细胞培养从上海生物科学研究所(中国上海)购买H9C2心肌细胞，细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的细胞培养基中培养，并置于37 ℃、5% CO2的培养箱中。

1.5 细胞活性测定96孔板中每孔接种3 000个H9C2细胞。24 h后，将细胞分别与从甘木通中分离的10个化合物(最终浓度分别为5、10和20 μmol·L-1)进行预培养12 h，然后用450 μmol·L-1的H2O2处理，1 h后，用新的培养基替换原培养基，24 h后往各孔加入20 μL MTT试剂，混匀，于37 ℃孵育4 h。弃上清后各孔加入150 μL二甲基亚砜，于37 ℃孵育30 min，用酶标仪检测各孔在570 nm处的吸光度(OD值)。

1.6 DPPH自由基清除活性测试将10 μL样品(终浓度分别为5、10、20 mol·L-1)与90 μL的乙醇充分混合均匀后加入200 μL 0.004% DPPH。将其混匀，然后立即放入紫外可见分光光度计，以监测517 nm处的吸光度下降过程，持续监测70 min，直到反应达到稳定状态。抗坏血酸是一种稳定的抗氧化剂，作为合成参考物，纯乙醇作为对照样品。IC50值表示清除DPPH抑制产生的50%自由基所需的浓度/%=[(空白样品吸光度值AB-被测样品吸光度值AA)/空白样品吸光度值AB]×100%。

1.7 还原能力测定用铁还原法评价从甘木通中分离得到的化合物的铁还原活性。取甘木通提取物乙醇溶液500 μL，分别加入等量0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲液和1%铁氰化钾，50 ℃孵育20 min，加入10%三氯乙酸2.5 mL，650 r·min-1离心10 min。取500 μL上层溶液与500 μL蒸馏水和100 μL 0.1% FeCl3混合，检测700 nm处的吸光值。

1.8 流式细胞术将H9C2心肌细胞与20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氢脱氢双烟酰基醇、5 μmol·L-1落叶松树脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷、5 μmol·L-1咖啡酸培养12 h，然后暴露于450 μmol·L-1H2O2中1 h，用PBS洗涤两次并收集细胞，加入5 μL Annexin V-FITC，4 ℃避光孵育10 min，用PI复染，10 min后测定各组凋亡率。

1.9 活性氧测量利用DCFH-DA流式细胞仪监测活性氧的生成。将H9C2心肌细胞与20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氢脱氢双烟酰基醇、5 μmol·L-1落叶松树脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷、5 μmol·L-1咖啡酸培养12 h，随后暴露于450 μmol·L-1H2O2中1 h，然后，将细胞加入含50 mmol·L-1葡萄糖的PBS中，在37 ℃环境下与10 μmol·L-1DCFH-DA孵育30 min，流式细胞仪测定非特异性细胞酯酶水解二氯二氢荧光素-二醋酸酯(DCFH-DA)与DCFH的荧光生成以及随后的过氧化物氧化DCFH的结果。

1.10 Western blot提取总蛋白后进行蛋白定量。在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶的电泳孔中分别加入marker和蛋白样品后在100 V恒压下电泳，250 mA恒流转膜，室温下用含5%脱脂奶粉的TBST将硝酸纤维素膜封闭1 h。然后孵育一抗：anti-caspase3(1 ∶1 000)、anti-HO-1(1 ∶500)，anti-GCLC(1 ∶500)和anti-β-actin(1 ∶10 000)。室温孵育二抗1 h，用HRP化学发光液显色。

2 结果

2.1 甘木通提取物的自由基清除作用和还原能力测定为了探究甘木通提取物对自由基清除活性是否有直接的抗氧化作用，采用DPPH法进行测定，结果显示，自由基清除率与木犀草素、二氢脱氢双烟酰基醇 、落叶松树脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸剂量呈正相关，其中木犀草素具有最高的清除活性(Fig 2A)。并且，我们测定了10种甘木通提取物对Fe3+转化为Fe2+的还原能力。铁还原法测定结果显示，还原力与木犀草素、二氢脱氢双烟酰基醇、落叶松树脂醇、芹菜素、黄芩苷、脲醛苷、咖啡酸和鼠尾草素浓度呈正相关，其中木犀草素还原力最高(Fig 2B)。

Fig 2 DPPH radical scavenging activities (A) and ferric reducing assays (B) of ten compounds from Clematis filamentosa Dunn.

2.2 甘木通提取物对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响MTT法测定结果表明，与对照组相比，20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氢脱氢双烟酰基醇、5 μmol·L-1落叶松树脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷和5 μmol·L-1咖啡酸处理组细胞存活率从(49.46±2.32)%(H2O2单独处理)显著增加到(96.1±5.49)%，(80.65±6.37)%、(73.75±5.35)%、(77.23±0.9)%、(69.89±1.83)%和(62.42±2)%(Fig 3)。这些结果表明，从甘木通中分离得到的化合物减弱了H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤。因此，基于以上研究结果，我们用20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氢脱氢双烟酰基醇、5 μmol·L-1落叶松树脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷和5 μmol·L-1咖啡酸进行进一步的研究。

Fig 3 Effects of ten compounds from Clematis filamentosa Dunn. on cell viability with or without 450 μmol·L-1 H2O2 in H9C2 cells

2.3 甘木通化合物对H2O2诱导的H9C2细胞内ROS水平的影响细胞内活性氧是细胞内的氧化应激指标[8]。DCFH-DA荧光探针研究结果显示，木犀草素、二氢脱氢双烟酰基醇、落叶松树脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸对H2O2诱导的活性氧升高有抑制作用。单纯H2O2处理的细胞平均荧光强度为(53.17±1.26)%。在H2O2诱导的H9C2心肌细胞中，木犀草素、二氢脱氢双烟酰基醇、落叶松树脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸处理后，其均值分别降为(9.48±2.05)%、(38.53±3.01)%、(12.62±2.13)%、(42.92±3.95)%、(10.5±1.39)%和(11.46±0.97)%(Fig 4A)。表明了甘木通提取物可以降低H2O2诱导的H9C2细胞内ROS的水平。

Fig 4 Effects of luteolin, dihydrodehydrodiconiferyl alcohol, lariciresinol, apigenin, urolignoside and caffeic acid from Clematis filamentosa Dunn. on ROS formation and apoptosis in H2O2-induced H9C2 cells

2.4 甘木通提取物对H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果表明，H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡率为(41.36±2.63)%，对照组为(2.73±1.34)%。在H2O2诱导的H9C2心肌细胞中，木犀草素、二氢脱氢双烟酰基醇、落叶松树脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸处理后，凋亡细胞的百分比分别下降到(10.5±2.69)%、(39.21±3.14)%、(12.31±1.58)%、(36.21±1.42)%、(13.21±2.09)%和(16.24±3.04)%(Fig 4B)。提示，甘木通提取物能显著抑制H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡。

2.5 甘木通提取物对H2O2诱导的H9C2心肌细胞中caspase-3和抗氧化酶表达的影响Western blot检测结果显示，450 μmol·L-1H2O2诱导后，cleaved-caspase-3的表达水平明显提升。木犀草素、落叶松树脂醇、脲醛苷、二氢脱氢双烟酰基醇、芹菜素和咖啡酸能使H2O2诱导的H9C2心肌细胞中caspase-3的活化受到抑制。木犀草素、二氢脱氢双烟酰基醇、落叶松树脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸处理H2O2诱导的H9C2心肌细胞中HO-1和GCLC蛋白水平显著升高(Fig 5)。我们的研究表明，通过抗氧化酶的激活，甘木通提取物可保护H9C2心肌细胞免受氧化损伤。

Fig 5 Effects of luteolin, dihydrodehydrodiconiferyl alcohol, lariciresinol, apigenin, urolignoside and caffeic acid from Clematis filamentosa Dunn. on caspase-3 and antioxidant enzyme expression in H2O2-induced H9C2 cells

3 讨论

甘木通能扩张血管并改善血循环，其成药“冠心康片”有缓解冠心病病人心绞痛的功效，但其确切的有效成分尚不明确，提示甘木通中活性成分对心肌细胞损伤的药理作用及机制值得进一步探讨。本研究从甘木通中提取得到木犀草素、咖啡酸、落叶松树脂醇、脲醛苷、二氢脱氢双烟酰基醇、芹菜素、黄芩苷、蒙花苷、齐墩果酸和鼠尾草素10个化合物。因此，甘木通的抗氧化特性可能与这些活性物质的存在有关。DPPH反应和还原能力测定结果表明，木犀草素的自由基清除能力和还原能力最强，其次是咖啡酸、落叶松树脂醇、脲醛苷、二氢脱氢双烟酰基醇、芹菜素、黄芩苷、蒙花苷、齐墩果酸和鼠尾草素。它们使H2O2诱导的氧化应激受到抑制，H9C2心肌细胞的存活率有所提高。其中木犀草素、二氢脱氢双烟酰基醇、落叶松树脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸具有较强的细胞保护作用，并进一步测定了它们对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护机制。

有报道指出，H2O2可通过刺激细胞产生ROS自由基诱发凋亡，ROS自由基过多已经成为缺血性心脏病的主要特征[9]。研究发现，ROS过量生成会导致线粒体渗透性转换孔(mPTP)进一步开放，从而使线粒体膜电位去极化，caspase-3通路被激活，诱导细胞凋亡[10]。大量的活性氧能诱导产生细胞自噬，从而造成细胞死亡[11-12]。本研究结果表明，从甘木通中分离得到化合物(木犀草素、二氢脱氢双烟酰基醇、落叶松树脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸)能够保护H9C2心肌细胞免受H2O2的损伤，降低H2O2诱导产生的活性氧积累，同时，抑制caspase-3的激活可进一步抑制细胞凋亡。因此，从甘木通中分离的化合物对H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡的抑制作用与caspase-3凋亡途径有关。

核因子NF-E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是氧化应激反应的转录因子，可与抗氧化反应元件ARE产生作用，诱导下游调控的多种解毒酶和抗氧化酶表达，使血红素氧合酶(heme oxygenase 1，HO-1)和谷胱甘肽(GSH)的表达水平提高[13]，清除自由基，细胞内氧化还原平衡得到维持，保护内源性细胞。甘木通提取物能够上调HO-1和GSH生物合成的限速酶(glutamate-cysteine ligase catalyzes the subunit，GCLC)的表达，提供了有效的内源性抗氧化防御机制。

综上，甘木通活性化合物能减少H2O2对H9C2细胞的损伤，提高细胞活性并抑制其凋亡，改善心肌细胞内氧化应激。这可能与H9C2心肌细胞中抗氧化酶的激活有关。这些结果为甘木通活性化合物的临床应用及心肌细胞损伤的药理作用提供了参考。