女金片的HPLC指纹图谱研究及聚类分析

王 玉，李 佳，陈广云，王 萍

（淮安市食品药品检验所，江苏 淮安 223300）

中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，建立在中药成分系统研究的基础上，可实现对中药整体物质的有效控制。自2010年版开始已载入中国药典，具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高、方法重现性好的特点，可反映待测样品的特征性和整体性[1-2]。

女金片由鹿角霜、陈皮、当归、白芷、川芎、延胡索、甘草、牡丹皮、黄芩、阿胶、益母草等23味中药按照一定的制法制成，是妇科常用中成药，具有调经养血，顺气化瘀之功效，临床上用于经血不调、赶前错后、腰腿酸痛等上述症状者[3-4]。目前多是关于女金片含量测定的报道，但其测定的成分较单一，不足以综合反映女金片的整体质量[5-7]。本试验采用高效液相法，以芍药苷为参照峰，在选定的色谱条件下，标定出9个色谱特征峰，建立了12批市售女金片的高效液相指纹图谱，同时进行了聚类分析，为女金片的质量标准建立及其质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪（DIONEX公司）；Milli-QR型超纯水机（美国密理博有限公司）；XS205-DU型电子天平（均为METTLER公司，精度为十万分之一）；XP-6型电子分析天平（均为METTLER公司，精度为百万分之一）；KH72000DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 试药

女金片均为市售（样品S1～S12批号分别为1903201，1804201，2002202，2011201，20200104，20201101，20181001，20191101，20201001，180009，180010，180007）；芍药苷对照品（批号：110736-201943；含量95.1 %）；橙皮苷对照品（批号：110721-201818；含量96.2 %）；黄芩苷对照品（批号：110715-201821；含量95.4 %），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯； 纯化水为自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[8-10]

色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪科马科技有限公司）；流动相：乙腈（A相）-0.05 %磷酸溶液（B相）按表1梯度洗脱；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；流速：0.8 ml/min；进样量：10 μl。

表1 梯度洗脱时间程序表

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取芍药苷对照品2.104 mg、橙皮苷对照品2.041 mg、黄芩苷对照品3.946 mg，置入50 ml量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取女金片细粉约1 g，精密称定，置入20 ml量瓶，加入稀乙醇15 ml，超声处理（功率160 W，频率50 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 参照峰的选择 在女金片指纹图谱中，通过与混合对照品图谱对照（见图1），指认出4号峰为芍药苷，4号峰的峰面积适中，分离完全，稳定性较好，设为参照峰（S）。以下试验均以各供试品溶液色谱图中4号峰的保留时间和峰面积值为参考，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

图1 高效液相色谱图

2.3.2 精密度试验 取女金片细粉约1 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按拟定色谱条件重复进样6次，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于0.36 %，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取女金片细粉6份，各约1 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按拟定色谱条件进样分析，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于0.71 %，表明方法重现性良好。

2.3.4 稳定性试验 取女金片细粉约1 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6，10，16，24 h进样，按拟定色谱条件进样分析，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于0.31 %，表明女金片供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 指纹图谱的建立及分析

2.4.1 指纹图谱的构建 取女金片样品（S1～S12），按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项色谱条件进行指纹图谱测定，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012年A版）进行数据导入、匹配、校正，建立女金片指纹图谱共有模式。根据匹配结果确定9个共有峰，并生成对照指纹图谱（R），见图2。通过与对照指纹图谱比较，计算各批次样品的相似度（见表2）；以芍药苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积（见表3、表4）。由表中数据可见，S1～S12号样品图谱与对照图谱的相似度均大于0.90，表明12批不同样品具有良好的相似性。

表2 12批女金片指纹图谱相似度

表3 12批样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间

表4 12批样品HPLC图谱共有峰的相对峰面积

图2 12批女金片的指纹图谱

2.4.2 共有峰的归属 取混合对照品溶液和供试品溶液，按拟定色谱条件进样，得到色谱图（见图1）。通过比较样品和混合对照品指纹图谱中共有峰的保留时间及紫外吸收光谱对共有峰进行归属，确认其中4号峰为芍药苷，6号峰为橙皮苷，7号峰为黄芩苷。

2.4.3 聚类分析 以3个厂家12批样品9个共有峰的相对峰面积为变量，采用SPSS 22.0软件，以组间平均数联结法及欧氏距离平方为测度对样品进行系统聚类分析，结果见图3。由图3可见聚类趋势，当类间距为5时，12批样品被聚为三大类：S1、S2、S3、S4聚为一类，S5、S6、S7、S8、S9聚为一类，S10、S11、S12聚为一类。每一类均为同一厂家产品，表明同一厂家产品质量具有较高的稳定性。

图3 12批样品聚类分析树状图

3 讨论

3.1 检测波长选择

中药复方制剂成分复杂，不同成分在不同波长下有最大吸收。文献采用230 nm测定女金片中芍药苷的含量[5]，橙皮苷和黄芩苷的含量时选用280 nm[6-7]。本试验中采用DAD检测器在200～800 nm波长对样品进行了全波长检测，结合文献[11-12]，比较不同波长下的图谱。结果表明，230 nm波长处得到的色谱峰数目较多，信息较为全面，故选择230 nm作为检测波长。

3.2 供试品溶液的制备

本试验对供试品提取溶剂的种类（甲醇、稀乙醇）、提取方法（超声、回流）和提取时间（15，30，60 min）进行考察。结果表明，甲醇提取效率低，部分共有峰分离度不符合要求；超声提取和回流提取的提取率无明显差异，但超声操作简便，用时较短，故选择稀乙醇超声作为供试品溶液的制备方法。

3.3 指纹图谱分析

本试验建立了女金片的指纹图谱共识别出9个共有峰，克服了单一化学成分作为质控指标的难题，较好地反应了该制剂的内在质量信息，为女金片的总体研究提供了理论参考依据。但本制剂药味众多，未能确认出每个共有峰的归属，因此，需要进一步完善该指纹图谱中共有峰的确认，为女金片质量标准的制定提供更多的数据支撑。

3.4 聚类分析

12批女金片的指纹图谱具有相同的色谱特征峰，但各色谱特征峰峰面积的相对比值有所差异。文献表明，原料药材来源及药材质量均会影响色谱峰峰面积，提示各厂家在选择药材投料生产前应注意药材成分含量的检测。