损伤相关分子模式在口腔恶性肿瘤中的研究进展*

朱记涛，曹菲菲，郭丽娟，杨森

563000 贵州 遵义，遵义医科大学口腔医学院 口腔颌面外科(朱记涛、郭丽娟、杨森);629000四川 遂宁，遂宁市中心医院 口腔颌面外科(朱记涛、曹菲菲、郭丽娟、杨森)

口腔恶性肿瘤是发生在口腔、颌面部的恶性肿瘤的总称，占全身恶性肿瘤的5%～10%，临床上主要采用手术治疗、放化疗等治疗方法，但其预后较差且给患者带来严重的身心影响[1]。口腔恶性肿瘤细胞的凋亡过去被认为是不具有免疫原性的，即放化疗等治疗不会诱导口腔恶性肿瘤细胞凋亡并释放抗原分子。但近年来研究表明，放化疗作用于口腔恶性肿瘤细胞后，凋亡的肿瘤细胞表面会释放一些特定的蛋白分子，如钙网蛋白(calreticulin，CRT)、热休克蛋白(heat shock protein，HSP)、高迁移率蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)以及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)等，即口腔恶性肿瘤细胞会从非免疫原性转化为免疫原性，从而增强机体的抗肿瘤免疫杀伤作用[2-3]。此过程被称为口腔恶性肿瘤细胞的免疫原性死亡(immunogenic death,ICD)，把介导ICD的蛋白分子称为损伤相关分子模式(damage-associated molecule patterns,DAMPs)。因此，可通过“DAMPs”这个新的概念来了解口腔恶性肿瘤细胞ICD的过程，以及免疫细胞对口腔恶性肿瘤的杀伤作用。本文拟对DAMPs在口腔恶性肿瘤治疗中的作用加以综述，以期为口腔恶性肿瘤的免疫治疗提供新的思路。

1 CRT与口腔恶性肿瘤

1.1 CRT概述

CRT被认为是一种高度保守的钙结合蛋白，分子量为46.5 kDa。CRT是一种分子伴侣，是HSP家族中的一种，可参与协调膜表面蛋白、外分泌蛋白及内质网(endoplasmic reticulum,ER)驻留蛋白的折叠与运输。但最近几年研究发现，CRT不仅存在于ER中，还存在于细胞核、细胞质、细胞膜中以及细胞外，行使特定功能。细胞核内的CRT调控基因的表达，细胞质及细胞膜中的CRT主要起到稳定Ca2+内环境的作用，Verneret等[4]发现细胞外的CRT能与血清补体C1q结合增强免疫原性。此外，细胞外的CRT能发出“进食”信号，进而激活树突状细胞(dendritic cell,DC)，被激活的DC将口腔恶性肿瘤抗原交叉递呈给细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells,CTL)，从而建立抗口腔恶性肿瘤免疫应答环境。孙巧珍等[5]发现平阳霉素作用于口腔鳞状细胞癌CAL27、SCC-15、Tca8113细胞后，细胞表面CRT表达量明显增加，继而增强了 DC及CTL对口腔鳞状细胞癌的免疫杀伤作用。固有免疫细胞表面受体CD91可与细胞外的CRT相互作用，两者结合后可使未成熟的DC变为成熟的DC，成熟的DC可产生白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)，从而增强对口腔恶性肿瘤细胞的吞噬作用[6]。

1.2 CRT与口腔恶性肿瘤的关系

在口腔恶性肿瘤细胞ICD过程中，CRT主要通过以下模式暴露于细胞表面：ER应激、细胞凋亡、囊泡转运。1)ER应激模式：蛋白激酶RNA样ER激酶(protein endoplasmic reticulum kinase,PERK)在ER应激模式中会使真核转录启动因子(phosphorylated α subunit of eukaryotic initiation factor 2，eIF2α)发生磷酸化[7]，磷酸化的eIF2α会通过以下途径把CRT暴露于细胞膜及细胞外：①CRT通过PERK/eIF2α/caspase8途径暴露到细胞膜；②CRT通过PERK/eIF2α/ATF- 4途径暴露于细胞外。在PERK下调或eIF2α未发生磷酸化的情况下，再使用放化疗等干预措施，细胞膜表面的CRT不会得到显著增加。研究显示活性氧(reactive oxygen species，ROS)也可通过ER应激模式促使CRT暴露，当使用ROS抑制剂后，CRT的暴露会受到明显抑制[8]。Hsiao等[9]发现姜黄素作用于口腔癌SAS细胞后，流式细胞仪检测细胞内ROS表达增加，增加的ROS会使CRT暴露，诱导口腔恶性肿瘤细胞发生ICD，与实验组相比，未使用姜黄素的SAS细胞，细胞膜表面CRT表达量较低。2)细胞凋亡模式：细胞凋亡模式与caspase- 8、BAP31 和Bcl- 2家族蛋白Bax和Bak蛋白息息相关。当下调或抑制上述蛋白时，口腔恶性肿瘤的免疫原性也会受到相应抑制，暴露在细胞膜上的CRT会相应降低。3)囊泡转运模式(ER-Golgi)：重新排列的肌动蛋白骨架会使CRT从ER转运到高尔基体，进而与囊泡相关蛋白VAMP1、质膜相关蛋白SNAP23相互作用，最终使CRT转运到细胞膜表面[10](图1)。

图1 CRT通过三种途径暴露于细胞膜表面

2 HSP与口腔恶性肿瘤

HSP被认为是一类高度保守的分子伴侣，广泛分布于细菌和哺乳动物之中。HSP包括HSP90、HSP70、HSP60及HSP27等，分子量依次递减。

2.1 HSP90与口腔恶性肿瘤的关系

近年来，HSP90已成为治疗口腔恶性肿瘤的热点，HSP90在口腔恶性肿瘤细胞中的蛋白量占比不足1%，可以与下游的蛋白(MIF,AKT,mTOR等)相互作用影响口腔恶性肿瘤细胞的生存[11]。Wu等[12]发现蒿甲醚作用于舌癌Cal27细胞后，细胞中HSP90，p-Akt和p-mTOR的表达下调，而Akt的表达没有明显改变，证实了HSP90 /Akt途径可能与蒿甲醚诱导的Cal27细胞凋亡有关。 研究显示，HSP90存在于恶性肿瘤的细胞表面，能与恶性肿瘤细胞表面的其他相关蛋白相互作用，调节恶性肿瘤细胞的生长、分化和转移[13]。HSP90与口腔恶性肿瘤新生血管的生成也有密切关联，它可以促进口腔恶性肿瘤生长[14]。Tatsuo等[15]发现当使用HSP90拮抗剂NVP-AUY922时，HSP90对口腔恶性肿瘤细胞的促增殖作用将减弱，实验结果表明NVP-AUY922具有抗口腔恶性肿瘤增殖作用。因此，可通过靶向抑制HSP90表达来抑制口腔恶性肿瘤的增殖。除抑制剂外，HSP疫苗，外泌体和miRNA技术等手段都可破坏HSP90对口腔恶性肿瘤细胞的保护作用，使口腔恶性肿瘤细胞发生裂解，凋亡[16-17]。

2.2 HSP70与口腔恶性肿瘤的关系

HSP70是一种主要存在于哺乳动物中的应激蛋白，分子量约为70 kDa,与正常细胞相比，应激状况下的细胞HSP70表达量显著增加。HSP70的一级结构由3个功能域构成：1)具有ATPase活性区的N端，分子量为45 kDa；2)多肽结合区域，分子量为18 kDa；功能是作为分子伴侣；3)C端的结构未得到彻底阐明，推测其可能与某一蛋白结合而发挥作用。HSP70在口腔恶性肿瘤微环境中发挥着双重作用，既可以激活细胞免疫，杀伤肿瘤细胞，又可以提高肿瘤细胞免疫逃逸能力，进而减少对肿瘤细胞的杀伤，保护肿瘤细胞[18-19]。研究显示，T细胞辅助因子Th1在细胞免疫中发挥重要作用，HSP70可通过增加Th1细胞与Th2细胞的比值来使Th1细胞增多，最终达到增强细胞免疫的效果[20]。此外HSP70与肽结合后，可激活T淋巴细胞，发挥抗口腔恶性肿瘤作用[21]。Fas是Caspase-8上游信号死亡诱导信号，HSP70可与其成员相互作用来抑制细胞凋亡[22]。此外在氧化应激模式下，HSP70可通过稳定Bcl-2来保护细胞免于凋亡。由于HSP70与组织相容性复合体I(major histocompatibility complex I，MHCI)及恶性肿瘤免疫原性的关系没有得到彻底阐明，HSP70对口腔恶性肿瘤细胞的保护机制有待进一步深入研究。

2.3 HSP60与口腔恶性肿瘤的关系

HSP60是分子量为60 kDa的伴侣蛋白，主要存在于真核细胞的线粒体中，由于HSP10也存在于线粒体中，所以两者可以相互作用。人类HSP60与HSP10基因并列位于2号染色体中，且共享双向启动子[23]。后来的研究发现HSP60不仅存在于线粒体中，在细胞质、细胞膜表面以及细胞外均有表达。HSP60的分子机制具有矛盾性，一方面，HSP60会先从线粒体释放出来，然后进入细胞质中，细胞质中的HSP60会激活Caspase-3，从而促进口腔恶性肿瘤细胞凋亡，另一方面HSP60可与前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(pro-Caspase-3，pC3)形成稳定的复合物，发挥抗凋亡作用[24]。Huang等[25]研究发现HSP60可以稳定凋亡抑制蛋白survivin水平并抑制p53使肿瘤细胞存活。正常细胞和口腔恶性肿瘤细胞的表面也可存在HSP60，口腔恶性肿瘤细胞表面的HSP60会先刺激DC，然后诱导T细胞发挥抗肿瘤免疫应答[26]。Zhou等[27]研究发现HSP60还可通过toll样受体4(TLR4)的信号传导来达到增强CD4+CD25+Fxop3+调节性T细胞功能。

2.3.1 HSP60具有致炎作用 HSP60可诱导线粒体应激(激活NLRP3炎性小体)和ROS生成并激活Caspase-1增强IL-1β的产生[28-29]。Chen等[30]发现HSP60激活NLRP3炎症小体可促进口腔恶性肿瘤的发生，当阻断NLRP3炎性小体表达时，口腔恶性肿瘤细胞的生长得到明显抑制。通过抑制HSP60/IL-1β通路可能为口腔鳞状细胞癌的治疗提供一种新思路。

2.3.2 HSP60可介导耐药性 HSP60可通过抑制肿瘤细胞内药物转运等机制造成肿瘤细胞耐药。HSP60在卵巢癌细胞中表达量显著增加，推测其与卵巢癌顺铂和奥沙利铂药物耐药有关[31-32]。同样对于大肠癌细胞，当抑制HSP60表达时，可逆转癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性[33]。Buscemi等[34]研究发现HSP60可以保护口腔癌细胞免受化疗药物的影响，并促进细胞增殖，这表明HSP60的过表达是口腔癌的一个危险因素，当使用HSP60抑制剂后，化疗药物对口腔癌的促凋亡作用明显增强，由此建议在口腔恶性肿瘤治疗中使用HSP60抑制剂。Campanella等[35]证明经典治疗口腔恶性肿瘤细胞药物紫杉醇可导致HSP60表达降低，从而显著促进口腔恶性肿瘤细胞凋亡，推测HSP60可能通过介导口腔恶性肿瘤耐药来促进口腔恶性肿瘤细胞凋亡。综上可知，HSP60介导口腔恶性肿瘤及其他恶性肿瘤细胞耐药，HSP60抑制剂通过抑制HSP60表达来解除肿瘤细胞耐药，进而促进肿瘤细胞凋亡。未来通过进一步研究HSP60及HSP60抑制剂与口腔恶性肿瘤耐药之间的具体作用机制，以期提高抗癌药物的作用效果，解决口腔恶性肿瘤细胞耐药的问题，提高口腔恶性肿瘤患者的生存质量。

2.4 HSP27与口腔恶性肿瘤的关系

HSP27是存在于细胞质中的低分子量伴侣蛋白(27 kDa)，其在低分子HSP家族中最为常见。HSP27主要通过自身磷酸化来发挥相应的功能，促分裂原激活蛋白激酶(MAPKAPK2、MAPKAPK4)、环磷酸鸟苷和蛋白激酶C可使HSP27磷酸化[36]。HSP27的作用靶点主要是丝氨酸15位、78位、82位(Ser-15、ser-78、Ser-82)的位点[37]。HSP27在口腔恶性肿瘤细胞中高表达，主要是因为其参与口腔恶性肿瘤的发生、转移与凋亡。Chen等[38]研究发现导致口腔腺样囊性癌细胞的侵袭性增强的机制之一是高表达的HSP27诱导上皮间充质转化。Zheng等[39]研究发现HSP27还可以和细胞色素结合从而阻止细胞色素与胱天蛋白质酶相互作用，达到抗口腔恶性肿瘤细胞凋亡的效果。Chen等[40]发现HSP27抑制剂槲皮素作用于口腔恶性肿瘤细胞后，其增殖能力得到明显抑制。综上可知，HSP27通过不同机制参与口腔恶性肿瘤细胞的增殖、转移与凋亡，HSP27抑制剂通过抑制HSP27表达来促进口腔恶性肿瘤细胞的凋亡。期待未来通过进一步研究HSP27及HSP27抑制剂在口腔恶性肿瘤细胞中的具体作用机制，为临床治疗口腔恶性肿瘤及其他恶性肿瘤患者提供新的思路，提高口腔恶性肿瘤患者的生存率和治愈率。

3 HMGB1与口腔恶性肿瘤

HMG于1970s在牛胸腺中发现，其亚类HMGB1含量最为丰富，分子量约为30kDa，主要存在于细胞核中。HMGB1由近端DNA结构域的A盒、B盒以及远端的C末端组成，其中A盒和B盒成碱性，而C末端呈酸性[41]。

HMGB1通过主动释放和被动释放两种方式从胞核经胞质分泌到胞外：。HMGB1在肿瘤细胞中具有两面性，一方面HMGB1可通过与糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)联合，激活NF-kB信号通路，最终促进口腔恶性肿瘤组织血管的生成，促进口腔恶性肿瘤细胞的浸润与转移，HMGB1与RAGE结合后还可通过JNK/P38/MAPK通路引起炎性反应[42-43]。研究显示，中晚期口腔癌细胞细胞外HMGB1就是通过此路径促进肿瘤细胞的浸润，当阻断HMGB1与RAGE的相互作用后，此信号通路减弱或完全消失，口腔恶性肿瘤细胞的浸润作用由此受到抑制[44]。Sakamoto等[45]研究发现HMGB1可与RAGE相互作用促进口腔鳞状细胞癌SAS细胞增殖，当使用HMGB1抑制剂FPS-ZM1后，SAS细胞的增殖能力受到明显抑制，且HMGB1与RAGE表达降低。另一方面，胞外HMGB1可以和抗原呈递细胞上的 TLR-4结合，诱导未成熟的DC成熟，从而增强对口腔恶性肿瘤细胞的杀伤作用[46-47](图2)。

4 ATP与口腔恶性肿瘤

ATP是口腔恶性肿瘤细胞发生ICD后最先被发现的DAMPs，ATP对于正常细胞来说无损伤作用，相反，其对口腔恶性肿瘤细胞的抑制作用较强[48]。

当I型ICD诱导剂(如化疗药物)作用于口腔恶性肿瘤细胞时，肿瘤细胞发生自噬而释放ATP，当II型ICD诱导剂(如Hyp-PDT)作用于口腔恶性肿瘤细胞时，可通过经典分泌途径以及PERK调节的分泌和PI3K激酶依赖性细胞外运输途径释放ATP[49]。胞外的ATP可与DC表面受体P2X7R、P2Y2R相互作用，诱导DC细胞成熟以及抗原的加工与呈递，成熟的DC细胞通过激活CD4+、CD8+T细胞以及NK细胞来发挥抗肿瘤作用[50]。此外ATP可被CD39和CD73水解为AMP+ADP+腺苷，腺苷水平的增加会抑制T细胞和NK细胞，从而促进口腔恶性肿瘤的发展与转移，使用CD73阻滞剂后，口腔恶性肿瘤的增长受到明显抑制[51](图3)。随着细胞外ATP在抗口腔恶性肿瘤的作用机制被进一步研究，未来口腔恶性肿瘤患者的治疗方式会得到进一步拓宽，患者的生存质量也会得到进一步提高。

图3 释放到胞外的ATP对肿瘤细胞的作用

5 结 语

ICD是细胞死亡方式的一种，它可以诱导DAMPs的释放，释放的DAMPs又可增强免疫系统对口腔恶性肿瘤的杀伤作用。DAMPs主要包括CRT、HSP、HMGB1、ATP等。

常见的放化疗可以使口腔恶性肿瘤细胞发生ICD，通过ER应激或ROS的产生诱导CRT、HSP70、HSP90的暴露以及HMGB1、ATP的释放，但上述信号分子的暴露或释放的阶段不同。可总结为ICD前、中、后三期：1)ICD前期：ER应激-CRT暴露，CRT+CD91刺激DC细胞杀伤肿瘤细胞；2)ICD中期：ATP的释放以及HSP70、HSP90的暴露，ATP可与P2X7R或P2Y2R结合，激活DC细胞来发挥抗肿瘤作用，而暴露的HSP70、HSP90也可通过多种途径参与抗肿瘤免疫治疗；3)ICD后期：HMGB1的释放，HMGB1+TLR4激活DC细胞成熟，成熟的DC细胞将抗原呈递给T细胞，从而杀伤口腔恶性肿瘤细胞。其他关于ICD抗口腔恶性肿瘤的免疫机制有待进一步研究。

新型的光动力疗法作为诱导ICD的一种物理方法，可诱导DC细胞成熟，DC细胞与口腔恶性肿瘤细胞相互作用，引起CD83、CD86、HLA-DR的表达以及IL-6、TNF-α等促炎因子的产生[52]。在口腔恶性肿瘤免疫治疗中，联合治疗相对于单一治疗效果更佳，如吡哆醇和顺铂联合作用于口腔恶性肿瘤细胞，导致更多的CRT、HSP70暴露及HMGB1及ATP释放[53]。联合治疗可作为口腔恶性肿瘤临床治疗的基础，用以提高患者的生存率。

通过前文介绍可知DAMPs在口腔恶性肿瘤细胞ICD中发挥重要作用。未来可进一步探索DAMPs的功能及所涉及的作用机制，为临床口腔恶性肿瘤治疗及药物研究提供更多思路。

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