鲜食甜、糯玉米自交系对拟轮枝镰孢菌穗粒腐病的抗性鉴定

胡颖雄,王 慧,靳林朋,关 媛,孙萍东,卫季辉,郑洪建,林金元

(1上海市农业科学院作物育种栽培研究所,上海 201403;2上海市农业科学院CIMMYT-中国特用玉米研究中心,上海201403;3上海市农业科学院上海特用玉米工程技术研究中心,上海 201403;4上海师范大学生命科学学院,上海 200234)

鲜食玉米是指在乳熟后期和蜡熟初期采摘果穗作食用或加工的玉米,主要包括糯玉米和甜玉米[1-2]。因其丰富的营养、良好的适口性,深受消费者喜爱[3-5]。近年来,随着人们生活水平的提高和膳食结构的变化,在市场经济的推动下,鲜食玉米生产在我国发展迅速,成为我国特别是东南沿海发达地区广大民众消费的重要果蔬品种。玉米穗粒腐病是世界上普遍发生、危害严重的一种真菌性病害,严重影响玉米的产量和品质[6-7]。随着耕作制度的调整、品种更换、气候因素变化等,穗粒腐病在我国多个鲜食玉米产区和制种区病情严重度不断升高,病害不断蔓延扩散。

玉米穗腐病病原菌种类繁多,国内外已经鉴定出40多种致病菌种,这些致病菌可以单独或复合侵染引起发病[8-10]。目前已报道的玉米穗腐病的主要致病菌包括镰孢菌(Fusariumspp.)、木霉菌(Trichodermaspp.)、青霉菌(Penicilliumspp.)、曲霉菌(Aspergillusspp.)、蠕孢菌(Helminthosporiumspp.)和链格孢菌(Alternariaspp.)等,其中镰孢菌为优势病原菌[11-15],过去的研究表明拟轮枝镰孢菌是我国玉米穗粒腐病第一大致病菌[16]。通过分析2016年在海南省主要玉米育种基地采集的玉米穗腐病样本,进行室内病原菌分离和鉴定,发现拟轮枝镰孢菌为优势病原菌[17]。2015—2017年在山东省采集的138份玉米穗腐病样品中检测到18种真菌,其中镰孢属的拟轮枝镰孢菌为优势菌,其次为层出镰孢菌[18]。2016年和2017年在河南及周边5省36地市玉米产区采用随机取样方法,采集到大量典型玉米穗腐病样本,经形态鉴定和分子鉴定,发现镰孢菌是该地区玉米穗腐病的主要病原菌,其中拟轮枝镰孢菌为该地区玉米穗腐病的优势病原菌[19]。

将镰孢菌属准确鉴定到种是玉米相关病害研究的基础。然而,单纯依靠传统的形态学鉴定很难准确区分镰孢菌属下各个种,即使对于非常专业的镰孢菌分类学者来讲,有时也需要借助生物学和分子生物学方法来区分这些疑难种类[20-21]。目前,根据TEF-1α基因序列对镰孢菌进行种的分类鉴定已经成为常用手段,国际上建立了基于TEF-1α基因部分序列的镰孢菌数据库,使得研究者可以方便地利用其基因序列将菌株鉴定到种[22]。

筛选抗病自交系、选育抗病品种是控制和预防鲜食玉米穗粒腐病的最根本和最有效的措施[23-24]。前期笔者通过分离鉴定上海地区鲜食玉米生产区的穗粒腐病样,发现拟轮枝镰孢菌是主要的致病菌。本研究利用针刺注射果穗接种法,对37份不同来源的鲜食玉米自交系种质资源进行拟轮枝镰孢菌的人工接种试验,以期从中筛选出遗传稳定的抗病优质鲜食玉米种质资源,为抗穗粒腐病优质鲜食玉米新品种的选育提供直接亲本。

1 材料与方法

1.1 供试材料

37份供试鲜食玉米自交系种质的种子均由上海市农业科学院作物所玉米生物技术课题组自交纯化繁育而来,种质资源及主要果穗农艺性状见表1。供试菌株为拟轮枝镰孢菌,由本课题组从田间自然发病的穗粒腐病样中分离鉴定而得。

表1 供试鲜食玉米种质资源Table 1 Germplasm resources of the tested fresh maize

1.2 试验方法

1.2.1 田间试验安排

鉴定试验在上海市农业科学院庄行综合试验站玉米基地进行,在试验基地不同的位置设置3个鉴定小区,每个鉴定小区分别种植供试鲜食甜、糯玉米自交系种质材料,行距60 cm,株距25 cm,每份自交系材料种植2行,每行20株。每个鉴定小区四周设1 m宽保护区,播种前对供试材料随机编号,在玉米整个生长期不使用杀菌剂。均人工接种拟轮枝镰孢菌。

1.2.2 拟轮枝镰刀菌的分离鉴定

从自然发病的鲜食玉米穗粒腐病病样品中剥取病健交界处3—5粒玉米籽粒,将样本籽粒置于1.5%的次氯酸钠溶液中浸泡3 min,再利用75%的乙醇溶液处理10 s,灭菌蒸馏水冲洗3次,最后用灭菌的滤纸吸干籽粒表面水分,将处理后的玉米籽粒放置在PDA培养基上,于28℃培养3—5 d,待菌落长出后,进行转接纯化,并在PDA培养基和CLA培养基上进行单孢分离培养获得纯化菌株。通过观察菌落颜色、形态等性状,利用光学显微镜观察记录分生孢子的形态、大小等基本特征,参考魏景超[25]和方中达[26]的方法对其进行初步鉴定。

菌株纯化培养后,刮取菌丝于研磨器中,加液氮研磨成粉末,提取菌株的基因组DNA。鉴定引物为EF-1F:5’-ATGGGTAAGGA(A∕G)GACAAGAC-3’,EF-1R:5’-GGA(G∕A)GTACCAGT(G∕C)ATCATGTT-3’(引物由上海生工公司合成)。PCR扩增体系为25μL,反应体系为:DNA模板0.5μL,2×Es Taq MasterMix 12.5μL,上下游引物各0.5μL,ddH2O补足至25μL。PCR反应程序为:95℃预变性5 min;95℃变性1 min,53℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存扩增产物。凝胶电泳检测PCR扩增产物,并将PCR目的产物进行测序,测序结果进行BLAST比对。利用MEGA 5.2软件进行同源树的构建。

1.2.3 拟轮枝镰孢菌的培养

将选取的拟轮枝镰孢菌4个不同菌株分别培养于PDA固体培养基上,28℃条件下培养5—7 d,待菌落菌丝长满1∕2平板时,4℃条件下保存待用。在接种前取适量玉米雄穗装入锥形瓶中,雄穗充满锥形瓶的1∕3—1∕2为宜,在高温高压灭菌30 min,连续灭菌2次,然后在超净工作台中将平板培养基上长好的4个拟轮枝镰孢菌菌落菌株分别接种到灭菌后的锥形瓶内,用封口膜封好瓶口,28℃条件下培养7—10 d。

1.2.4 接种液的制备

在准备进行人工接种试验前1 d,用无菌的蒸馏水将锥形瓶内已经培养好的拟轮枝镰孢菌分生孢子从雄穗组织上分别洗脱下来,然后用两层灭菌纱布过滤,得到孢子悬浮液,分别测定其浓度,保证选取的4个拟轮枝镰孢菌分生孢子浓度为1∶1∶1∶1的配比条件下混合配制拟轮枝镰孢菌菌液浓度为5×106个∕mL的悬浮液。在悬浮液中滴入表面活性剂吐温-80,吐温-80在悬浮液中的浓度为2μL∕mL,摇匀备用。

1.2.5 人工接种

玉米吐丝后10 d为最佳接种时期。采用针刺注射果穗接种法,剂量为2 mL,接种后以纸胶带粘在接种点,防止菌液流出,同时具有保湿效果[27]。接种部位:雌穗中部。接种工具:不锈钢可调连续喷雾注射接菌器。

1.2.6 穗粒腐病抗性分级评价标准

性状调查采用病情评级的标准,将抗性等级分为5级:1、3、5、7、9,其中1为高抗,9为高感(参照《玉米抗病虫性鉴定技术规范NY∕T 1248.8—2016》,表2)[28]。性状调查时间为籽粒生理成熟后。抗性等级划分标准参照了《玉米抗病虫性鉴定技术规范NY∕T 1248.8—2016》:平均病情级别≤1.5,抗性等级为高抗(HR);平均病情级别为1.5<平均病情级别≤3.5,抗性等级为抗(R);平均病情级别为3.5<平均病情级别≤5.5,抗性等级为中抗(MR);平均病情级别为5.5<平均病情级别≤7.5,抗性等级为感(S);平均病情级别为7.5<平均病情级别≤9.0,抗性等级为高感(HS)。

表2 抗性评级标准Table 2 Methods for evaluating resistance

2 结果与分析

2.1 自然发病条件下鲜食玉米穗粒腐病原菌侵染症状及分布

致病病原菌多从鲜食甜、糯玉米果穗的梢部或中部开始向下侵染,在籽粒上或籽粒间产生菌丝体,多呈现白色、粉红色或褐色,发病较重时玉米籽粒褐变或者干瘪(图1)。此外,致病病原菌也会侵染果穗籽粒的虫蛀部位,使籽粒呈现深褐色,伴随着白色稀疏霉层,在潮湿环境下霉层可迅速扩散并布满整个玉米果穗。

图1 田间自然发病条件下的鲜食玉米自交系穗粒腐病果穗样本Fig.1 The ear rot samples of fresh maize inbred lines under natural field conditions

2.2 拟轮枝镰孢菌的形态特征

在采集的鲜食玉米穗粒腐病样品中,分离获得拟轮枝镰孢菌。在PDA培养基中拟轮枝镰孢菌的气生菌丝呈现白色丛卷毛状至毛毡状(图2A),随着菌落培养时间的增长,菌丝的颜色由粉色慢慢变成灰紫色,培养基背面菌落色素的颜色也从无色素,到灰黄色再到暗紫色,最后呈现出黑色。在PDA培养基上于28℃培养4 d后,菌落直径为3.6—4.5 cm。利用CLA培养基进行分生孢子的形态和大小等特征观察,结果显示小型分生孢子较多,呈棒槌形,没有或有1分隔(图2B),在适宜的条件下,小型分生孢子多串生呈链状排列,有时聚集形成假头状(图2D)。大型分生孢子纤细,为不对称的拟纺锤形,背腹两侧近似平行,略弯曲,壁较薄,基细胞为不明显的足跟状,5—7个分隔(图2C)。在形态学鉴定过程中未观察到厚垣孢子。

图2 拟轮枝镰孢菌形态特征Fig.2 The morphological characteristics of F.verticillioides

2.3 TEF-1α基因序列分析

以EF-1F和EF-1R为引物,利用菌株6-1-1、14-2-2、25-3-1和37-3-2的基因组DNA进行目标片段的PCR扩增,PCR产物纯化后测序,分别得到了大小为687 bp、685 bp、690 bp和686 bp的片段(图3)。用Blast检索以上菌株的TEF-1α基因序列,与GenBank中已有的TE F-1α基因序列进行比对,发现菌株6-1-1和25-3-1与GenBank上登记的来自大西洋中部地区的拟轮枝镰孢菌MH496631和MH496632,中国的KP732009,西班牙的MN861769和MN861768,以及韩国的HQ622574;菌株14-2-2和37-3-2与丹麦的FN179338亲缘关系较近,序列同源性达99%。利用MEGA 5.2软件绘制系统发育树图,结果表明,菌株6-1-1、14-2-2、25-3-1和37-3-2与以上亲缘关系较近的轮枝镰孢菌位于同一分支,聚为一类(图4)。利用TEF-1α基因序列分析证实本研究中采用形态学特征分离鉴定出的拟轮枝镰孢菌的结果是准确可靠的。

图3 引物EF-1F和EF-1R扩增菌株的PCR产物片段Fig.3 The PCR product fragments of pathogen isolates with the primers EF-1F and EF-1R

图4 菌株6-1-1、14-2-2、25-3-1和37-3-2的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of isolates 6-1-1,14-2-2,25-3-1 and 37-3-2

2.4 不同鲜食玉米自交系种质资源的穗粒腐病抗性比较

2019年在庄行试验基地三个不同的区域分别对37份鲜食玉米自交系人工接种拟轮枝镰孢菌,并以3个区域抗性评级的均值对玉米穗粒腐病的抗性进行了评价(图5,表3)。结果表明,供试的37份鲜食玉米自交系种质在接种拟轮枝镰孢菌后,其抗性表现差异明显。Hw53、Hw71、Hw175、Ht219和Ht253共5份自交系对拟轮枝镰孢菌表现为高抗玉米穗粒腐病,Hw20、Hw50、Hw51等13份自交系对拟轮枝镰孢菌表现为抗玉米穗粒腐病,Ht233、Ht239、Ht245和Ht247共4份自交系对拟轮枝镰孢菌表现为中抗玉米穗粒腐病,中抗以上自交系种质材料占总体供试自交系的59.46%。在22份糯玉米自交系种质中,对拟轮枝镰孢菌表现抗病的种质有14份,占参试糯玉米自交系种质总数的63.63%;在15份甜玉米自交系种质中,对拟轮枝镰孢菌表现抗病的种质有8份,占参试甜玉米自交系种质总数的53.33%。

表3 鲜食玉米自交系穗粒腐病的抗性鉴定结果Table 3 The results of resistance evaluation of ear rot in inbred lines of fresh maize

图5 人工接种条件下部分鲜食玉米果穗抗性鉴定结果Fig.5 The results of resistance evaluation of ear rot in some inbred lines of fresh maize under artificial inoculation conditions

3 结论与讨论

玉米穗粒腐病是玉米灌浆后期及生产制种中常见的真菌性病害之一,主要以镰孢菌侵染导致发病,将镰孢菌准确鉴定到种是穗粒腐病害研究的基础。然而镰孢菌相近种在形态学上差异很小[20-21],通过形态学鉴定镰孢菌属各个种成为研究上的难题。镰孢菌翻译延长因子TEF-1α基因序列表现出广泛的序列多态性,其在镰孢菌属下各个种的分类水平上都具有各自的特异性分子标记,因而TEF-1α基因序列已成为镰孢菌进行种分类鉴定的常用手段[29-31],因此,本研究在形态学鉴定的基础上,采用TEF-1α基因序列分析作为辅助鉴定手段,提高了鉴定结果的准确性。

本研究中选取的菌株6-1-1、14-2-2、25-3-1和37-3-2的TEF-1α基因序列系统发育树结果表明,本研究分离鉴定的拟轮枝镰孢菌与大西洋中部地区,西班牙,韩国,丹麦等地区分离鉴定出来的拟轮枝镰孢菌亲缘关系最近,序列同源性达99%。这表明拟轮枝镰孢菌在世界上不同地区分布广泛,对全世界的玉米种植和生产造成严重危害,而且该菌能产生伏马毒素(FB)和T-2毒素[32-35]。这些毒素对于人类健康和畜牧业的可持续发展构成了严重的威胁[36-37]。在玉米生产和制种过程中,一般传统上采用化学药剂来防治玉米穗粒腐病,不仅防治效率低,并易造成农药污染。因此通过发挥植株自身的抗性,选种抗病鲜食玉米品种是穗粒腐病防治最为经济有效的方法。

鲜食玉米自交系穗粒腐病的抗性鉴定结果受多种因素的影响。果穗苞叶的厚薄直接影响籽粒感染拟轮枝镰孢菌的难易程度,从而导致植株果穗籽粒穗粒腐病的抗性差异。甜玉米相对糯玉米更易感染穗粒腐病,甜玉米和糯玉米在籽粒内容物的成分组成上存在较大差异,糯玉米淀粉含量较高,甜玉米的糖成分含量较高,甜玉米和糯玉米籽粒内容物组成成分的差异导致在面对拟轮枝镰孢菌的侵染时表现出不同的应急免疫反应,从而导致植株的抗性出现差异。由于玉米自交系穗粒腐病的抗性鉴定试验受多种因素影响,因此在进行穗粒腐病抗性遗传相关研究时,应建立稳定可靠的人工接菌抗性鉴定体系[38]。本研究筛选出5份对拟轮枝镰孢菌表现高抗的种质,分别为Hw53、Hw71、Hw175、Ht219和Ht253。这5份鲜食玉米自交系种质可作为抗源,用于鲜食甜、糯玉米穗粒腐病抗性品种选育及其抗性遗传机制研究。

本研究中穗粒腐病抗性鉴定的种质资源材料大部分具有亚热带及温带血缘的遗传背景,遗传多样性较丰富,研究结果显示这些种质材料对于拟轮枝镰孢菌具有不同的抗性表现。种质资源是玉米抗病育种的基础物质,近代玉米育种突破性品种的育成,无一不取决于优异遗传种质资源的发现和利用。因此需要进一步拓展种质资源基础,积极引进热带、亚热带的玉米新种质,同时利用地方品种种质资源,突破因种质资源不足而限制玉米抗穗粒腐病育种发展的瓶颈,进而为玉米抗穗粒腐病的品种选育提供坚实的种质基础和技术支撑。