男性解脲脲原体感染对精液质量、精子功能及辅助生殖妊娠结局的影响*

梁鲁南 孙宝刚 曹井贺 董业浩 刘贞辉

济宁医学院附属医院（山东 济宁 272029）

近些年，有关男性生殖健康越来越受到医疗界的关注。其中解脲脲原体(UU)和人型支原体(MH)是引起男性泌尿生殖道感染的常见病原体。有研究显示当前临床上男性不育症患者精液泌尿生殖系支原体感染，主要为单纯性解脲脲原体感染，二者混合感染次之，单纯感染人型支原体则较少[1]。泌尿生殖系支原体感染与男性不育的关系已展开了广泛的研究，但仍有争议[2]，同样关于生殖道支原体感染与辅助生殖助孕结局的关系也一直存有争议[3]。而男性不育患者伴有支原体感染对体外受精-胚胎移植的治疗结局的影响鲜有报道。

基于以上研究背景，通过分析男性解脲脲原体感染患者精液质量及其精子功能、辅助生殖妊娠结局以及后代情况，探讨男性支原体感染对精液质量、精子功能、辅助生殖妊娠结局以及出生后代的影响，为临床上对此类患者进行生育能力评价、治疗措施的选择、妊娠结局的预测、对子代的影响等提供依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾分析济宁医学院附属医院生殖医学中心2016年1月至2019年12月主要不孕原因为输卵管因素行辅助生殖助孕，其中130例男性解脲脲原体感染阳性，女性阴性患者作为实验组，男女支原体阴性患者为205例纳入对照组。所有患者均为第一次治疗周期，进行助孕治疗前均经过详细的一般情况检查、体格检查、内分泌检查、遗传学检查和至少两次精液分析。对进入研究的对象严格筛选，排除以下因素：①具有严重生殖系统异常的患者；②女方存在不孕原因，染色体核型正常46，XX，未发现已知的影响辅助生殖助孕妊娠结局的疾病（其通过HSG或者宫腔镜、腹腔镜手术以及超声检查证实）；③男方存在遗传性疾病；④伴有泌尿生殖系统外科疾病；⑤有特殊用药史，如激素类、细胞毒药物；⑥有特殊职业暴露史，如毒物、高强辐射、化工、农药、高温、高湿等；⑦有不良生活史，如吸烟＞10支/天、酗酒、电脑接触＞8 h/天等。

二、方法

（一）实验方法

采用支原体特异培养基进行培养（试剂盒由珠海市丽拓生物科技有限公司提供），严格按照试剂盒操作说明进行操作。男性通过手淫法获取精液进行支原体检测，将标本接种于培养基上，培养基置于37℃恒温培养箱中培养，于24小时后对培养结果进行判读，培养基颜色由黄色变为红色者为UU阳性，仍为黄色者为阴性。

（二）精液常规分析

1.计算机辅助精子分析（CASA）：采用计算机辅助精子分析仪（西班牙，SCA）检测精子密度、总数、各级运动精子百分率和数量等。

2.精子形态学分析（Diff-Quik法）：检测精子形态正常率=畸形精子数/计数精子总数×100%

3.精子功能检查

依照WHO技术规范采集、处理和检测精液标本，检测实验组与对照组相关精子功能指标。精子-透明质酸结合率；精子核蛋白不成熟率；精子DNA碎片率，

（1）精子顶体酶活性检测：使用精子顶体染色试剂盒（PSA-FITC，深圳华康生物）检测精子顶体酶活性，简要步骤如下：测定精液常规参数后，测定和对照Ep管中加入7.5×106个精子，离心去除精浆，按照试剂盒使用说明操作，依次加入相关试剂，水浴后离心，紫外分光光度计读取各管405 nm的OD值，计算顶体酶活性。（2）精子核蛋白组型检测（苯胺蓝染色法，深圳华康生物）：利用洗涤液稀释精子浓度至40×106/ml，对于小于该浓度的样本进行离心浓缩）。取上述调整后的精液1 mL加Eppendorf管内，1000×g离心10 min，去除精浆。加1ml洗涤液，充分混匀。1000×g离心3 min去上清液，如此共洗涤3次。最后一次离心弃上清液后，加1ml粘合液。取5μl调整后的精液涂片，空气干燥。加固定液固定90s，甩去固定液。玻片以自来水轻轻冲洗7次，甩去玻片表面积水，加染液覆盖膜片区，染色5 min。以自来水缓缓冲洗，然后将膜片浸泡至洗脱液中准确脱色18-20 min，或至膜片无明显蓝色为止。立即甩去脱色液，以自来水快速洗涤7次。迅速吹干或晾干后加封固液1滴，以盖玻片封片。油镜计数200个精子，不成熟核蛋白组型转换异常精子头部呈蓝色，计算头部着色精子百分率。

（3）精子DNA碎片检测[精子染色质扩散实验（SCD）法，深圳博锐德生物科技有限公司]：检验方法：（1）试剂及室温准备:将易熔凝胶管置于80℃孵育20 min，待完全融化后，将易熔凝胶管置于37℃待用。检测前将室温调整至20-28℃；（2）标本制备：将液化的新鲜精子浓度用生理盐水调整至((5-10)×106/ml；（3）检测方法：严格按照试剂盒使用说明给出的检测方法进行检测；（4）精子DNA碎片判定标准：精子头部仅产生较小的光晕或无光晕，单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1/3。SDF（%）=存在DNA碎片精子数/被观察精子总数×100%。

（4）精子-透明质酸结合率检测（深圳博锐德生物科技有限公司）：将10μl液化的精液加入透明质酸包被的载玻片(测定孔)“T”孔后待精液白然扩散到(对照孔)“C”盖上盖玻片孔；室温放置10min后，在400倍显微镜下观察精了与玻片上的透明质酸结合情况，计数500个活动精了，精了-透明质酸结合率(%)=(“T”孔被结合精了数/“T”孔计数活动精了总数-“C”孔被结合精了数/“C”孔计数活动精了总数)×100%。

（三）临床操作

控制性超促排卵：实验组与对照组女方均选择长方案超促排卵：于启动周期前次月经黄体中期肌注GnRH。达菲林1.33mg，月经第3天开始使用Gn促排卵，月经第6天起，行阴道B超检查卵泡和子宫内膜发育情况，并以此及时调整用药。直至有2～3个主导卵泡直径在18mm以上时，结合激素检测结果提示卵泡发育成熟，停用促排卵药物，于当晚8点注射hCG5000-10000u。注射hCG后34～36小时在阴道B超引导下穿刺取卵，记录取卵数。

（四）胚胎实验室操作

1.精子处理：为了减少或者去除精浆的抗精子抗体，细菌，免疫活性细胞，杂质，达到符合要求的精子浓度，促进精子获能，改善精子受精能力等，将实验组与对照组在授精前须对精子进行必要的处理。采用密度梯度分离法分离：其具体步骤为：取精子密度梯度分离培养基，吸取1ml下层(高密度)分离培养基置于离心管中，再吸取1ml上层分离培养基(低密度)缓慢地注于下层分离培养基的上面．两层培养基的中间形成一个清晰的界面，37℃培养箱复温。小心吸取1ml培养基化的精液覆盖于上层分离培养基的液面。以（300～600）×g的速度离心20min。移去所有的分层溶液，只剩底部的沉淀。加2～3ml洗精培养基，将沉淀混匀。200×g离心5min。移去上清，再加入洗精培养基，重复离心洗涤步骤。用0.5ml IVF洗精培养基沉淀。进行精于计数和精子质量评估。将处理获得的精子调整密度（50～300）×103／mL为宜，后置5%CO2、37℃、95%湿度培养箱待用。

2.受精及胚胎培养：

实验组、对照组采用常规的体外受精。受精后18h观察原核，出现2个原核和2个极体为正常受精卵，未出现2PN为受精完全失败。取卵后培养72h观察胚胎形态，将优质胚胎移植到宫腔内。胚胎移植后14天检测尿或血HCG阳性，移植后4～5周时超声检查见胎心搏动为临床妊娠。移植时先选择常规受精来源的胚胎，若无常规受精来源胚胎则移植ICSI受精胚胎。

3.胚胎按以下评分标准分级：

形态学指标：4’-卵裂球大小均匀，碎片为≤5%；3’-卵裂球大小均匀或不等，碎片6%～20%；2’-卵裂球体积相等或不等，碎片21%～50%；1’-卵裂球少，碎片＞50%。1、2级胚胎在发育过程中出现下列情况，胚胎评级时在形态学基础上降一级:①授精20h内未见到原核，48h证实为延迟受精的胚胎。②取卵后48h超过8细胞或72h未超过5细胞。正常受精4、3级胚胎为优质胚胎。

（五）计算公式

受精率=正常受精卵数/卵-冠-丘复合体数×l00%；优质胚胎率=优质胚胎数／卵裂数×l00%；着床率=B超观察到的妊娠囊数/移植胚胎数×l00%；临床妊娠率=临床妊娠例数/移植周期数×l00%；生化妊娠率=生化妊娠周期数/妊娠周期数；流产率=孕28周前流产周期数/临床妊娠周期数；早产率=发生妊娠≥28足周至≤37足周的早产分娩数/产妇总数×l00%。

三、统计学处理

实验数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析。计量资料用x±s表示，比较采用单项方差分析；计数资料用率（比值）表示，比较应用卡方检验。P＜0.05认为有统计学意义，P＜0.01有显著统计学意义。

结 果

一、实验组与正常组一般资料比较

比较实验组与对照组患者：男、女方年龄、不孕年限、窦卵泡数、女方基础FSH、女方基础LH、HCG日E2、HCG日子宫内膜厚度差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 实验组与对照组一般资料比较

二、比较实验组与对照组患者

实验组与对照组，精液参数中，精液量、精液浓度、前向运动率、精子活动率比较无统计学意义（P＞0.05）。对照组正常形态率组高于实验组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 男性解脲脲原体感染对精子质量的影响

三、男性解脲脲原体感染对精子功能的影响

对比实验组及对照组精子功能指标发现：实验组顶体酶活性、精子-透明质酸结合率与对照组相比无统计学意义（P＞0.05），实验组的DNA碎片率、核蛋白组型大于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 男性解脲脲原体感染对精子功能的影响

四、男性解脲脲原体感染对辅助生殖结局的影响

辅助生殖组当中，实验组的受精率、卵裂率，优质胚胎率、着床率、生化妊娠率、临床妊娠率与对照组相比均无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 男性解脲脲原体感染对辅助生殖结局的影响

五、男性解脲脲原体感染与对照组对子代影响

实验组与对照组早产率、后代出生体质量（3.150kg±0.57 vs 3.11kg±0.65）、双胎妊娠率、男婴比例、出生缺陷率两两比较后显示无统计学意义（P＞0.05），男性实验组流产率高于正常组，而无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 男性解脲脲原体感染对子代影响

讨 论

约15%的男性不育与生殖道感染有关，解脲脲原体是生殖道感染和男性不育的主要且常见的致病性因素，支原体感染对精液质量的影响已有较多的研究，但一直缺乏共识，有研究显示，与正常男性相比，男性支原体感染患者其精液指标诸如精液量、精液浓度、精子活力，正常形态率等无明显差异[4-5]，而有研究表明解脲脲原体感染可导致精子浓度、精子活动力和精子正常形态率下降[6]。

本研究结果显示，男性支原体感染患者精子浓度，精子存活率、精子活力与对照组相比，无明显差异，而精子正常形态率与对照组相比降低，精子核蛋白组型及精子DFI较健康对照组升高。本研究表明男性支原体感染可能会导致精子形态及精子DNA完整性显著下降，进而导致男性不育。其机制可能是男性支原体感染导致精子膜完整性受损，影响精子的形态和功能[7]，其次是解脲脲原体感染对精子的影响可能与氧化应激的过程有关[8]。

随着不孕不育的发病率逐渐增加，辅助生殖技术（ART）的应用愈加普遍，其中体外受精-胚胎移植（in vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET）可以解决因排卵、精子、输卵管等因素造成的不孕。解脲脲原体作为泌尿生殖道最为常见的病原体，目前关于其与不孕症、辅助生殖助孕结局、不良妊娠结局的关系仍存有争议。有研究显示，伴有支原体感染的女性不孕患者对IVF-ET,胚胎植入和胎盘形成产生负面影响，从而增加胚胎种植失败以及增加早期妊娠流产的可能性,从而造成反复种植失败或反复妊娠流产[9-10]。而男性不育患者伴有支原体感染对体外受精-胚胎移植的治疗结局的影响鲜有报道。

VeigaE等[11]发现在IVF过程中常规筛查并处理生殖道解脲脲原体感染可以提高精液质量，从而提高胚胎着床率和妊娠率。Wittemer等[12]认为体外受精程序并不能完全消除解脲脲原体对精子的不良影响，同时其可进入子宫微环境，改变局部微生物群，导致炎症反应，从而影响胚胎着床和发育。而也有研究显示[13]：精液中UU的存在虽并不影响IVF受精率和妊娠率，但解脲脲原体实验组IVF后流产率较高。有研究发现IVF助孕失败组与助孕成功组中解脲脲原体检出率差异无统计学意义，对于接受IVF助孕患者，解脲脲原体实验组与对照组受精率、卵裂率、优质胚胎率、种植率、临床妊娠率、异位妊娠率和流产率差异均无统计学意义[14-17]，我们的研究显示IVF-ET组当中男性实验组的受精率、卵裂率，优质胚胎率、着床率、生化妊娠率、临床妊娠率异无统计学意义；男性实验组与对照组早产率、后代出生体质量（3.150kg±0.57 vs 3.11kg±0.65）、双胎妊娠率、男婴比例、出生缺陷率两两比较后显示无统计学差异，男性实验组流产率高于正常组，而差异无统计学意义。其研究显示在辅助生殖过程过程中，经过对精子离心洗涤等处理，在之后进行的精卵结合，胚胎的处理过程中避免了解脲脲原体感染对受精卵及胚胎着床等的不良影响，并且受精卵无需经过输卵管运输，降低了输卵管感染的不良影响。

我们研究发现男性解脲脲原体感染对男性精液质量、精子功能有一定的影响，而对辅助生殖妊娠结局可能无明显不良影响。但目前关于其致病机制仍未完全明确，并且由于本研究中样木量不够充足，因此，需要更大的样本量和更敏感的研究方法以及多中心大样本进行进一步的研究。可成为今后研究努力的方向。