维生素D对小鼠精原干细胞增殖和凋亡的影响及机制研究*

李婧 刘丽萍 杜黎 崔迎红 谢梨 田玫 曾媛 李健，2**

1.湖南师范大学医学院,模式动物与干细胞生物学湖南省重点实验室（湖南 长沙 410013）2.湖南师范大学医学院小分子靶向药物发现与创制湖南省重点实验室（湖南 长沙 410013）

1α,25-(OH)2D3（1α,25-dihydroxyvitaminD3）是维生素D活性形式，是调节人体内钙磷稳态方面的脂溶性类固醇，能够促进钙、磷等物质吸收，可促进骨的形成和骨吸收，对人体的生长、骨骼发育、机体代谢具有重要影响[1]。而且，研究发现1α,25-(OH)2D3能抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡[2]。

近年来越来越多研究发现维生素D对男性睾丸组织、精原细胞和精子功能有着重要影响。有动物研究表示小鼠从早期3周开始喂养维生素D含量不足的食物，7周导致睾丸的重量下降、精子质量下降，睾丸精子细胞增殖受抑制、血清和睾丸睾酮下降，睾丸睾酮合成酶下调，生殖能力下降，可见维生素D摄取不足导致睾丸发育和精子形成受损[3]。精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)附于曲细精管的基底膜上[4]，是男性将遗传物传递给子代唯一的成体干细胞，是一切精子发生的基础。然而，翻阅各种文献发现有关1α,25-(OH)2D3对精原干细胞的作用的研究甚少。1α,25-(OH)2D3是否会对精原干细胞的增殖和凋亡产生影响呢？其具体的作用机制是什么呢？本研究将为维生素D的研究提供新的材料，为男性不育的治疗提供新的靶标与干预途径。

材料和方法

一、主要实验材料和试剂

1,25-(OH)2D3（美国Sigma公司），DMEM/F12基础培养液（美国Gbico公司），磷酸盐缓冲液(PBS)（美国HyClone公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司），DMSO（二甲基亚砜）（美国Gbico公司），FBS（胎牛血清）（美国Gbico公司），CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司），Annexin V and Propidium lodide（PI）试剂盒（中国赛默飞世尔有限公司），反转录试剂盒（艾科瑞生物公司），qRT-PCR荧光定量试剂盒（艾科瑞生物公司）。C18-4细胞株由模式动物与干细胞生物学湖南省重点实验室赠予。

二、细胞的培养和传代

将C18-4细胞复苏后，放入DMEM/F2培养液（含10%血清）的培养皿中，置于细胞培养箱（37℃,5%CO2）。细胞达到80%后先用PBS冲洗3遍，用适量的胰蛋白酶消化，进行传代。

三、qRT-PCR对小鼠精原干细胞系C18-4细胞鉴定

用qRT-PCR对C18-4细胞Dazl、Plzf、Oct-4、Thy1、Gfra1基因进行检测,以Gapdh为内参。实验步骤：采用胰蛋白酶消化C18-4细胞，采用Trizol法进行RNA提取，逆转录cDNA，然后进行PCR扩增。PCR扩增程序：95°C5min，（95°C10min，72°C7min，60°C30s）35个循环，每个样本重复3次。Gapdh基因引物序列为F：5’-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3’,R:5’-ACACATTG GGGGTAGGAACA-3’;Gfra1基因引物序列为F:5’-ATCCCTTTCCATTTTGCTGGCGTCC-3’,R:5’-CATC CTGGGCTCCTTCCT-3’;Plzf基因引物序列 为F:5’-CTGTGGCAAGAAGTTCAGCCTCAAG-3’,R:5’-CAC TGGTATGGCGAGGC-3’;Oct-4基因引物序列为F：5’-CCTGGCTTCAGACTTCGC-3’,R：5’-GCTTTCCACT CGTGCTCC-3’;Dazl基因引物序列为F:5’-GATGGATGAAACCGAAATCAGG-3’,R:5’-TCTGCACATCCACGTCATTATA-3’;Thy1基 因 引 物 序 列 为F:5’-TCGCTCTCCTGCTCTCAGTCTTG-3’,R:5’-CATCCT TGGTGGTGAAGTTGGCT-3’.

四、免疫荧光法对小鼠精原干细胞系C18-4细胞鉴定

将培养C18-4细胞用胰蛋白酶消化后用DPBS洗两次，离心去上清，加入4%多聚甲醛溶液，放置于室温下固定10min，用DPBS洗三次，每次5 min，随后用适量PBS重悬细胞于甩片机上400g/min,离心2 min，进行细胞甩片。继续用含5%BSA室温下封闭1h，封闭后直接加入一抗4℃共孵育，过夜。吸进后DPBS洗三次，每次5min。继续加入二抗在室温下孵育1h，一定要完全避光。DPBS洗三次，每次5min，加入DAPI室温共孵育8min，DPBS洗三次，每次5 min。最后加入防荧光猝灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察并拍照。

五、CCK-8法检测细胞活力

将收集到的C18-4细胞用胰蛋白酶消化细胞并接种于96孔培养板内，每孔接种活细胞数为1×105个，培养液为加入了10%FBS、DMEM/F2培养液，每个梯度设置3个重复孔，每孔内培养液总体积为100μL，96孔板进行37℃、5%CO2浓度、湿度的条件下孵育24h，PBS清洗3遍，加入1α,25-(OH)2D3处理。实验分为5个梯度：0（对照组加入同等浓度的DMSO）、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M。设置12h、24h和48h 3个培养时间。37℃、5%CO2浓度、湿度的条件下孵育48h。每隔12h、24h、48h取出 一个96孔板，每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续培养4h。4h后从培养箱取出，将96孔板放入酶标仪，并调制450nm波长，用于检测吸光度值。

六、流式细胞仪检测细胞凋亡率

将C18-4细胞以每孔5×106个细胞接种于六孔板，并设立3个对照孔(Blank、FITC和PI)，24h后加1α,25-(OH)2D3浓度为10-7M，处理48h后收集上清液加入1ml PBS打 散 细 胞，1000r离 心5min，弃上清液，加入300-500μL binding buffer（1X），分别加入5μL Annexin V溶液和1μL100μg/ml PI溶液，避光孵育细胞15min。孵育后添加400μL的1X Annexin结合缓冲液，通过流式细胞仪检测。

七、qRT-PCR法测定维生素D处理对基因表达的影响

10-7M1α,25-(OH)2D3浓度处理C18-4细胞48h后，用胰蛋白酶消化细胞，用Trizol提取总RNA，通过逆转录形成cDNA后 进 行PCR扩 增。95°C5min，（95℃10min，60℃30s）经过40个循环，最后熔解曲线（95℃15s，60℃60s，95℃15s）。每个样品设置3个复孔，实验结果用Gapdh作为内参照，采用2-ΔΔCT进行结果分析。引物序列:Gapdh：F:5’-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3’,R:5’-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3’;Pcna：F：5’-TTTGAGGCACGCCTGATCC-3’,R:5’-GG AGACGTGAGACGAGTCCAT-3’;Bax：F:5’-CCGGCGAATTGGAGATGAACT-3’,R:5’-CCAGCCCATGAT GGTTCTGAT-3’;Bcl-2：F:5’-GCTACCGTCGTGACTT CGC-3’,R:5’-CCCCACCGAACTCAAAGAAGG-3’;Vdr：F:5’-GTGCAGCGTAAGCGAGAGAT-3’,R:5’-GGATG GCGATAATGTGCTGTTG-3’。

八、统计学方法

实验数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析，以均数±标准差（Mean±SD）表示，两组之间的比较采用两独立样本t检验，多组之间相比较采用单因素方差分析，若方差齐，采用LSD法，如若方差不齐，则采用Dunnett’s T3法检验。P＜0.05则表示有差异，具有统计学意义。

结 果

一、细胞鉴定

RT-PCR结果 显示Dazl、Plzf、Oct-4、Thy1、GFRA1基因均有表达（图1A），免疫荧光染色显示C18-4细胞表达GFRA1和PLZF蛋白（图1B和C），通过两种方法鉴定细胞为小鼠精原干细胞，可用于后续的实验。

二、CCK-8法检测1α,25-(OH)2D3对C18-4细胞细胞活力的影响

采用CCK-8法检测不同浓度和作用时间的1α,25-(OH)2D3对C18-4细胞细胞活力和增殖的影响，结果显示：与对照组比较，10-7M、10-9M和10-10M浓度的1α,25-(OH)2D3处理24h后C18-4细胞活力显著降低（P＜0.05)；10-7M的1α,25-(OH)2D3处理48h后C18-4细 胞活力显著降低（P＜0.05)。因此，后续实验我们选择1α,25-(OH)2D3作用浓度为10-7M（图2）。

图1 小鼠精原干细胞的鉴定图A：RT-PCR凝胶电泳结果图；B和C：GFRA1和PLZF蛋白在细胞中的表达结果图(×200倍)

图2 1α,25(OH)2D3处理C18-4后细胞活力的CCK-8检测结果

三、1α,25-(OH)2D3对C18-4细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪（AnnexinV/PI染色）检测10-7M浓度的1α,25-(OH)2D3处理对C18-4细胞48h后细胞凋亡的影响，结果显示：与对照组相比，10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理小鼠精原干细胞导致C18-4细胞总凋亡率和晚期凋亡率趋势增加，而早期凋亡率显著增加（P＜0.05)（图3）。

四、1α,25-(OH)2D3对C18-4细胞增殖和凋亡的相关基因的影响

采用qRT-PCR方法检测1α,25-(OH)2D3对C18-4细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响，结果显示：与对照组相比，10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理小鼠精原干细胞导致C18-4细胞Bax基因（1.00±0.02 vs 1.16±0.06，P＜0.05）、Vdr基因（1.00±0.04 vs 1.33±0.01,P＜0.05）表达明显上升，Bcl-2基因（1.00±0.05 vs 0.57±0.06，P＜0.05）和Pcna基因（1.00±0.03 vs 0.82±0.01，P＜0.05）表达明显下降（图4）。

图3 1α,25(OH)2D3对小鼠精原干细胞凋亡的影响

图4 1α,25-(OH)2D3对C18-4细胞Bcl-2、Bax、VdrA和Pcna mRNA表达的影响

讨 论

研究报道1α,25-(OH)2D3除了对钙磷代谢有调节作用以外，还具有抑制细胞增殖、促进凋亡等作用，这其中包括对多种肿瘤细胞具有调节作用，可以抑制乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等肿瘤的生长[5]。经食物与阳光紫外线摄取一定数量的维生素D可以预防肿瘤[6]，这可以归纳为1α,25-(OH)2D3能抑制肿瘤细胞的增殖。有研究表明：1α,25-(OH)2D3通过维生素D受体（VDR）非依赖性的方式激活了蛋白激酶C、促分裂原活化的蛋白激酶A和磷脂酰肌醇3-激酶等，从而引起体内的钙离子变化，及体内各种蛋白失去活化的状态，最终影响细胞的增殖与凋亡[7,8]。

精原干细胞具有自我更新能力，能够将基因传递至子代，因此精原干细胞是精子发生的至关重要的载体[9]。本研究CCK-8法实验结果显示：与对照组相比，10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理小鼠精原干细胞后24h和48h细胞活力均降低。此研究结果与Ooi B等的研究[10]一致，他们的研究发现1α,25(OH)2D3对小鼠的系膜细胞增殖具有调节作用。1α,25-(OH)2D3与靶细胞上的VDR结合后,调控靶细胞的相关功能。本研究qRT-PCR显示10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理C18-4细胞后Vdr基因表达显著上调。此研究与Srikuea R等[11]研究结果一致。其研究表明C2C12骨骼肌细胞经1α,25-(OH)2D3(20 nM)或25(OH)D3(2 M)处理后，Vdr基因表达显著上调。Pcna基因与细胞增殖有关，G0/G1期是决定着细胞增殖的速度，G1期的增加与细胞的凋亡有关，因为G1期阻滞可能导致抗增殖[8]。Pcna基因与这种细胞增殖与凋亡周期有关，在DNA合成的G1期开始增加，S期到达顶峰，至G2/M期又降下来[12]。Pcna基因的表达可能是因为细胞内游离的Ca2+增加，从而能抑制细胞增殖。本研究结果显示10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理小鼠精原干细胞后Pcna基因表达下降。说明维生素D可能通过抑制Pcna基因的表达，而抑制精原干细胞的增殖，进而导致精原干细胞Vdr基因表达增加。

凋亡是细胞命运的重要方面。本研究流式细胞仪（AnnexinV/PI染色）实验结果显示：与对照组相比，10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理小鼠精原干细胞导致总凋亡率和晚期凋亡率趋势增加，而早期凋亡率显著增加，说明小鼠精原干细胞较高浓度的维生素D作用细胞凋亡增加。Bax基因属于Bcl-2基因家族的一员，大多数Bax蛋白质位于细胞浆中以单体形式存在，如果细胞接受凋亡信号，则Bax基因可以提高线粒体渗透性，改变线粒体，并转化孔开放，随之释放细胞色素C,最后激活下游半胱天冬酶Caspase的级联反应,细胞凋亡产生[13]。Bcl-2基因是Bcl-2家族里最重要的抗凋亡因子[15-17]。Bcl-2通过减少凋亡诱导因子与同家族基因Bax结合阻抑凋亡蛋白酶等，产生抗凋亡作用[18]。Bcl-2基因作为广义的凋亡基因有着许多外号，例如长寿基因，在各界备受关注。它可以经过抑制细胞内Ca2+超载,减低脂质过氧化物对中枢神经系统的毒性作用,调节细胞凋亡[19,20]。当Bax基因表达时，Bax的相对量大于Bcl-2，并且Bax/Bax同源二聚体的量大于Bcl-2/Bax异源二聚体的量，其表示促进细胞凋亡;反之，当Bax的相对量少于Bcl-2,并且异源二聚体Bcl-2/Bax的量高于同源二聚体Bax/Bax,则表示为抑制细胞凋亡[14]。本研究结果显示10-7M浓度1α,25-(OH)2D3处理小鼠精原干细胞后Bax基因表达显著上调，而Bcl-2基因表达显著下调。说明维生素D通过影响Bax/Bcl-2途径，导致精原干细胞凋亡增加。

因此，本研究发现较高浓度的1α,25-(OH)2D3会抑制精原干细胞的增殖和促进精原干细胞的凋亡，这些与维生素D影响精原干细胞Bax、Bcl-2，Pcna基因和Vdr基因mRNA表达有关。本研究为维生素D对精原干细胞增殖与凋亡调控的作用及其相关机制提供了新材料。但是，精原干细胞体外培养离开了睾丸组织微环境，高浓度的维生素D摄取是否会通过抑制精原干细胞的生长,从而抑制精子发生，这有待动物实验和临床研究来确证，以进一步明确维生素D在男性生殖功能中的作用。