基于网络药理学前列舒乐颗粒治疗良性前列腺增生症的作用机制探讨*

刘胜京 杜冠潮 高庆和 张继伟 晏 斌 赵 丰 郭 俊 郭 军

中国中医科学院西苑医院男科（北京 100091）

良性前列腺增生症 （benign prostatic hyperplasia,BPH）俗称前列腺增生，是以前列腺中叶增生为实质改变，突入膀胱或尿道内，压迫膀胱颈部或尿道，从而引起下尿路梗阻的一组症候群，主要表现为尿频、尿急和进行性排尿困难等症状，是中老年男性的常见病与多发病[1]。BPH在中医属于“癃闭”范畴，在《素问·宣明五气》云：“膀胱不利为癃”，主因膀胱气化不利或气化无权所致，病位主要在肾与膀胱，涉及三焦、肺、脾、肝，其中脾肾虚衰为重要病因之一[2]。

前列舒乐颗粒是由淫羊藿、黄芪、蒲黄、车前草、川牛膝5味药材组成的上市中成药，具有补肾益气，化瘀通淋的功效，可用于肾脾双虚、气滞血瘀之BPH及慢性前列腺炎的治疗[3]。目前临床研究结果表明，前列舒乐颗粒对于BPH具有较好的治疗效果。但是，前列舒乐颗粒作为中药复方制剂，其所含活性成分较多，目前对其治疗BPH的机制研究匮乏，不能从整体上反应其多成分、多靶点治疗BPH的作用特点，因此需要一项新的药理学研究思路，从整体角度对前列舒乐颗粒治疗BPH的作用机制进行全面分析。

网络药理学是基于复杂网络关系研究药物治疗机制的一种手段，符合中药治疗疾病多靶点的思路，因此将网络药理学与中药作用机制研究相结合具有较好的优势及潜力。本研究以前列舒乐颗粒复杂化学成分为研究对象，运用网络药理学和生物信息学技术等方法预测前列舒乐颗粒有效成分的作用靶点，深入探讨前列舒乐颗粒治疗BPH的作用机制。

材料与方法

一、前列舒乐颗粒药物活性成分的筛选

应用中药系统药理学分析平台[4]（TCMSP，http://tcmspw.com）及中医药整合药理学研究平台[5](TCMIP,http://www.tcmip.cn)收集前列舒乐颗粒中淫羊藿、黄芪、蒲黄、车前草、川牛膝的化学成分。以ADME参数中的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18为限制条件进行筛选，并在PubMed及中国知网查阅相关药物化学成分研究或综述文章进行检验，补充未纳入的重要成分，最后依据目前基于HPLC、LC/MS等方法已经鉴定出的前列舒乐颗粒成分进行比对补充，构建前列舒乐颗粒的活性成分数据库，并在PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）确认其分子结构。

二、药物活性成分作用靶点及疾病靶点的获取

通过pharmmaper数据库（http://www.lilab-ecust.cn），获得活性成分最相关的靶点信息。利用GeneCards、OMIM数据库搜索疾病的靶点，关键词设置为“benign prostatic hyperplasia”，获得与BPH相关的疾病靶点。

三、药物靶点与疾病靶点相映射

利用R软件，将上述得到的药物靶点与疾病相关靶点相映射，得到前列舒乐颗粒治疗BPH的潜在作用靶点。

四、靶点间相互作用分析

将映射后得到的药物与疾病的共同靶点导入STRING平台（https://string-db.org），构建靶点间蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI），选取最低相互作用阈值大于0.9的数据，获得PPI网络文件，将节点信息node与combined score值导入Cytoscape软件，计算节点与节点之间相互作用值（degree值）并进行图形化展示，获得最终PPI网络图。

五、基因本体与通路富集分析

利用R软件通过基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)对核心靶点进行生物学过程及作用通路分析，并将结果以气泡图及圈图的形式呈现。

六、“药物-活性成分-作用靶点-富集通路”可视化网络图构建

根据上述分析得到的药物活性成分、作用靶点及核心信号通路，利用Cytoscape软件构建前列舒乐颗粒“药物-活性成分-作用靶点-富集通路”的可视化网络图。

结 果

一、筛选的前列舒乐颗粒药物活性成分

基 于TCMSP、TCMIP数 据 库，以OB≥30%且DL≥0.18为标准对前列舒乐颗粒药物成分进行筛选，共得到65个化学成分，其中来源于淫羊藿23个、黄芪20个、蒲黄8个、车前草10个、川牛膝4个。通过进一步阅读文献及依据目前基于HPLC、LC/MS等方法已经鉴定出的前列舒乐颗粒成分[6-8]，黄芪中的黄芪甲苷（astragalosideⅣ），蒲黄中的香蒲新苷（typhaneoside）、异鼠李素-3-O-新橙皮苷（Isorhamnetin-3-O-neohesperidoside），车前草的大车前苷（plantamajoside），川牛膝中的杯苋甾酮（cyasterone），虽然OB或DL值较低，但均已被证实为相关药物的主要活性成分，因此也被纳入潜在的活性成分进行分析。最终确定复方中共70个潜在活性成分，其中，淫羊藿、黄芪、蒲黄、车前草、川牛膝的潜在活性成分个数分别为23、21、10、11、5。

二、获取的药物活性成分作用靶点及疾病靶点

通过pharmmaper数据库获得药物的相关靶点，去重后共得到相关靶点134个。通过GeneCards、OMIM数据库获得与BPH相关靶点共868个。

三、药物靶点与疾病靶点相映射

利用R软件，将上述得到的134个前列舒乐颗粒的药物靶点与868个与BPH相关度较高的疾病靶点相映射，得到61个前列舒乐颗粒治疗BPH的潜在作用靶点。

四、靶点间相互作用分析

将映射后得到的药物与疾病的共同靶点导入STRING平台，选取最低相互作用阈值大于0.9的数据，经Cytoscape处理后得到PPI蛋白互作网络，见图1。图中节点的大小和颜色深浅反映节点之间degree值的大小，颜色越深表示节点之间关系越强；节点之间的连线粗细反映了结合率评分（combined score）的大小，连线越粗表示节点结合率越高。通过PPI互作网络分析，可见蛋白互作频次最高的为肿瘤抑制基因（TP53），其次激素受体如雄激素受体（AR）、雌激素受体（ESR1）、糖 皮 质激素受体（NR3C1），5α还原酶（SRD5A），肾上腺素能受体Alpha1A（ADRA1A），生长因子相关受体（EGFR、ERBB2）、炎症相关受体（RELA、IL6）、核蛋白转录因子（FOS）、特异性周期蛋白（CCND1）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK8）、核受体辅激活蛋白基因（NCOA1）、凋亡信号相 关分子（CASP3、CASP8、MYC）等，是整个网络的节点蛋白。

图1 共同靶点蛋白互作网络

五、基因本体与通路富集分析

（一）核心靶点GO富集分析 对核心靶点进行GO分析，即从生物过程（biological process,BP）、细胞组分（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）对基因功能进行注释，以显著性（P）＜0.05、错误发现率（FDR）＜0.05为条件筛选，发现核心基因主要富集在1285个BP、23种CC和92种MF。前列舒乐颗粒治疗BPH的生物学过程包括类固醇激素反应、氧化应激反应、凋亡信号通路调节以及对酮、金属离子及紫外线的反应等；这些靶点在细胞组分中与膜阀、膜微孔、膜受体、核染色质及转录因子复合物、激酶复合物有关；在分子功能中与蛋白连接酶、转录因子活性、核受体活性、类固醇结合相关度较大。分别列出BP、CC、MF排名前10的富集结果，见图2。图中柱状图的高度代表富集的靶点数目，颜色深浅代表富集的显著程度，颜色越红代表显著程度越高。

（二）核心靶点KEGG富集分析 对核心靶点进行KEGG富集分析，筛选条件同GO分析，共得到112条具有显著意义的通路，这些通路主要与前列腺癌、细胞凋亡、内分泌抵抗等相关通路有关，查阅文献后挑选与BPH相关度较大的10条通路，并与相关基因进行对应，绘制圈图分析，见图3。图中圆圈左半部分为与通路有关的基因；右半部分为与BPH相关度较高的通路；圆圈中间的线为通路与基因的对应关系。因目前实验研究多从信号通路进行探讨，研究方法更为成熟，可操作性更强，故剔除疾病及广义通路后，得到10条相关度最高的信号通路，纳入网络图分析，见图4。

图2 核心靶点GO富集分析气泡图

六、“药物-活性成分-作用靶点-富集通路”可视化网络图构建

基于复杂网络展现前列舒乐颗粒中“药物-活性成分-作用靶点-富集通路”之间的关系，见图4。图中正方形代表药物，菱形代表药物活性成分，圆形代表作用靶点，箭形代表预测与BPH相关度较高的信号通路；颜色与大小根据degree值决定，颜色越深、形状越大代表节点之间的关系越强，在网络图中的地位越重要。在图4中可以看出，左侧菱形部分为前列舒乐颗粒药物治疗BPH的主要活性成分，分为君药（淫羊藿）、臣药（黄芪）、佐使药（蒲黄、车前草、川牛膝）以及药物相同成分四个部分来表示，体现了中医药配伍中“君臣佐使”的配伍关系；中间圆形部分为前列舒乐颗粒治疗BPH的预测靶点；右侧箭形部分为前列舒乐颗粒治疗BPH潜在相关度较高的信号通路。

图3 核心靶点KEGG富集分析圈图

讨 论

传统中药复方的机理研究多针对某单一通路，通过实验手段逐一筛选作用靶点，存在选择较为主观及效率低下等问题，且中药复方成分较多，往往不是单一对应关系，因此中药复方的机制研究适合从整体上把握其之间的网络关系。本研究基于网络药理学及生物信息学等研究方法，对前列舒乐颗粒进行深入研究，为药物的动物实验及进一步产品研发提供了较好的思路，同时也为临床多靶点、多通路的复方研究提供借鉴。

本研究经数据库筛选得到前列舒乐颗粒的70个主要活性成分及134个作用靶点，与BPH作用靶点相映射后，得到61个药物治疗疾病的潜在靶点，说明前列舒乐颗粒治疗BPH覆盖范围较广。通过前列舒乐颗粒药物分析及图4的网络图，可以看出其君药淫羊藿中的淫羊藿苷与臣药黄芪中的毛蕊异黄酮（Calycosin）在网络中均发挥重要作用。涂梅琳等[9]发现淫羊藿苷对增生的前列腺组织有明显抑制作用，且与剂量成正相关关系。而黄芪改善BPH的相关症状已有临床研究[10]，动物实验发现其可明显逆转大鼠前列腺组织增生[11]，而作用机理可能为毛蕊异黄酮可降低血清中睾酮和二氢睾酮的浓度[12]。从图4中可以看出，槲皮素为网络中重要节点，一项随机双盲临床试验证明槲皮素对减轻BPH症状，增加尿流率有较好的效果[13]。通过药物成分及网络图分析，可以看出君药及臣药药少力专，在网络图中发挥主要作用，佐使药既辅助君药及臣药协同发挥作用，又有各自靶点独立针对疾病发挥作用，药物之间展示了良好的“君臣佐使”配伍关系。

目前关于BPH的发病机制主要有雌/雄激素对前列腺细胞增殖和凋亡的调控，上皮与基底细胞相互作用，生长因子作用以及炎症等[14-15]。通过PPI网络分析显示，在网络中处于重要节点位置的雄激素受体（AR）、雌激素受体、5α还原酶，α1型肾上腺素能受体、表皮生长因子受体及炎症相关受体（RELA、IL6）等均已有相关研究证明与BPH有关[16-18]。前列腺为雄激素依赖性器官，而睾酮作为最重要的雄激素，可直接与AR结合产生生物活性，此外睾酮还可以与5α还原酶受体结合，被转化为活性更强的双氢睾酮促使前列腺的增生，因此抑制5α还原酶可减轻BPH的相关症状。并且有研究显示，睾酮和双氢睾酮的转化及与AR的结合会发生受体配体复合物的核转位，同时招募其它辅助调节因子如NCOA1等与靶基因上的AR反应原件结合，共同调控靶基因的表达。前列腺及膀胱颈平滑肌内均有α受体分布，增生组织高于正常组织，且以α1A受体为主，其递质去甲肾上腺素释放增加致平滑肌张力增强，膀胱颈及尿道内压力增高，排尿阻力增加，引起下尿路梗阻症状。通过网络药理学预测前列舒乐颗粒治疗BPH的相关生物活动的机制，分析结果与既往BPH发病机制吻合度高。前列舒乐颗粒可能通过抑制α受体活性，舒张尿道平滑肌张力，减轻膀胱颈及尿道内压力。同时抑制5α还原酶活性，调节血清及前列腺组织睾酮双氢睾酮水平，降低血清及前列腺组织睾酮及双氢睾酮含量、增加雌激素含量，抑制前列腺血管增生等途径来起到治疗BPH的作用。

KEGG通路分析较显著的通路有前列腺癌通路、细胞凋亡通路、内分泌抵抗通路，相关激素通路如雄激素信号通路、雌激素信号通路、催乳素信号通路、甲状腺激素信号通路以及PI3K-Akt、MAPK、p53、TNF等通路，与已有BPH研究吻合度较高。PI3K-AKT信号通路调节细胞生长、分化、增殖与代谢等多种生物学过程，与细胞生存及细胞分裂密切相关，通路激活后，使其底物发生磷酸化，并与蛋白结合发挥抑制细胞凋亡与促进细胞增殖的作用[18]。有动物实验研究，阻断PI3K-Akt信号通路具有抑制前列腺增生的作用[20,21]。MAPK信号通路是将信号从细胞表面传递到细胞核内部的重要环节，其基于磷酸化的信号形式进行三级激酶模式传导，与免疫相关疾病、组织器官纤维化、个体发育、组织器官再生及癌症发生发展等密切相关。有研究表明，p38MAPK通路的活化参与了前列腺上皮和间质增生的调控，在细胞增殖过程中引起生长因子及雄激素的缺乏，导致去除效应从而激活p38通路，促进细胞凋亡以抵抗前列腺增生[22,23]。而PI3K-AKT与MAPK信号通路存在相互作用关系[24]，p38MAPK及PI3K-AKT通路可进一步联合分析以探究前列舒乐颗粒治疗BPH的作用机制。

本研究通过网络药理学及生物信息学的分析方法，预测了前列舒乐颗粒治疗BPH的作用机制，体现了前列舒乐颗粒治疗BPH多成分、多靶点、多途径的治疗特点。本研究主要成分通过TCMSP及TCMIP筛选后进行文献校对，并经HPLC、LC/MS等实验方法确认其成分，药物作用靶点通过PharmMapper服务器基于反向分子对接方法进行预测，相比于仅依据数据库检索成分及根据分子二维结构相似性寻找靶点，预测结果更为准确，为进一步实验验证提供了更强有力的理论依据。