伊木萨克提取物及其组合物对复合应激性ED大鼠阴茎组织中ET-1与eNOS、nNOS表达的调控作用研究*

侯鹏程 阿卜杜热伊木江·如则 毛吾兰·买买提依明 刘文娟 斯依提·阿木提 阿地力江·伊明**

1.新疆医科大学基础医学院人体解剖学教研室（新疆 乌鲁木齐 830011）2．新疆医科大学基础医学院生物学教研室

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是指阴茎持续（至少6个月）不能达到或维持充分的勃起以获得满意的性生活，以阴茎不举或举而不坚为主要特征，并常伴有性欲减低和早泄等症状，属于男科最常见的疾病之一[1,2]。前期工作中，我们以环境雌激素污染与西北地区寒冷这一气候特点为切入点，采用雌激素样饲料联合冷应激复合干预方法建立了复合应激性ED大鼠模型[3]，并结合伊木萨克片的干预进行了系列研究，初步揭示了复合应激性ED的发病机制与伊木萨克片的有效性[4,5]。现为推动该药的二次研发，我们对该药处方原药材采用不同方法进行了提取，并获得醇提物（alcohol extract,AE）、水提物（water extract,WE）和提取物组合物（combination of extracts，COE）[6]，随后我们在复制复合应激性ED模型并研究其NO-cGMP通路与神经内分泌改变的基础上，对伊木萨克提取物及其组合物进行了药效评价和活性跟踪，并进一步探讨其对ED相关指标的调控作用。本文现对复合应激性ED大鼠阴茎组织中ET-1、eNOS和nNOS蛋白表达改变与伊木萨克提取物及其组合物的调控作用的研究结果报道如下。

资料与方法

一、资料

（一）实验动物

雄性清洁级SD大鼠160只和雌性大鼠20只，体质量（230±20）g，购自新疆医科大学实验动物中心。

（二）主要实验仪器

人工气候室（西安富康空气净化设备工程有限公司，新疆医科大学实验动物中心提供）,2135型切片机（德国莱卡）。

（三）主要试剂和药物

1.主要试剂：鼠单克隆NOS1、NOS3抗体（sc5302，sc376542，Santa Cruz，美国），小鼠单克隆抗体anti-ET-1（ab2786，abcam，美国），兔单克隆抗体anti-GAPDH（ab181602，abcam， 美 国）， 山 羊 抗 小 鼠/兔IgG（ZB-2305/ZB2301，北京中杉金桥公司），通用型SP试剂盒（SP-9000，中杉金桥），酒精、氯化钠等常规试剂及耗材均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2.药物：伊木萨克水提物、醇提物和提取物组合物由研究团队提供（专利号：CN202010285248.2）；伊木萨克片（20170702，和田维吾尔药业股份有限公司）。

二、方法

（一）实验动物准备

从经过交配实验证实具有正常性功能的160只性成熟雄性SD大鼠中随机抽取15只作为正常对照（N）组，其余145只SD大鼠作为造模（M）组，实验前适应性饲养1周，大鼠自由饮食，饲养环境温度为（22±2）°C，湿度为（55±5）%。

（二）环境雌激素样饲料的制备

按每1 kg大鼠常规饲料中加入芫荽籽和菠菜籽各150 g，饲料由新疆医科大学实验动物中心提供。

（三）复合应激大鼠模型的建立与ED模型的筛选

正常对照组以常规方法饲养，每日提供500g普通饲料、1000ml水、200g垫料。造模组以10:00-22:00/22:00-10:00为时间标准分2个时间段交替放入温度为（8±2）℃、湿度为（85±5）%的人工气候室中，每日给予500 g雌激素样饲料，水与垫料同上。造模组与正常组均随机饮食水，以12小时为周期模拟昼夜给予人工照明。在动态检测大鼠性功能改变的基础上，于造模35w后，通过交配实验筛选出ED模型，共106只，成模率为73.1%。

（四）分组与药物干预

将筛选出的ED大鼠模型随机分为ED组（12只）、AE组（12只）、WE组（12只）、COE组（12只）及Yimusake组（12只），并设立N组（15只）。其中Yimusake组则以伊木萨克片按照250mg/kg剂量进行干预，AE组、WE组及COE组按照伊木萨克片给药剂量×相应提取物出膏率确定给药剂量，即醇提物（67.88mg/kg）、水提物（18.7mg/kg）、提取物组合物（86.58mg/kg）进行干预，ED组和N组予以等剂量蒸馏水灌胃，干预周期3周，给药频率为1次/日。

（五）标本采集

干预结束后，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（40mg／kg体质量）进行麻醉，迅速取下阴茎组织，后半部分于福尔马林溶液中保存；前半部分置于2ml冻存管，速冻于液氮后转移至-80℃冰箱中保存。

（六）免疫组织化学检测

标本以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、脱蜡至水。pH 9.0 EDTA-Tris缓冲溶液进行抗原修复；3%H2O2去离子水孵育阻断内源性过氧化物酶。去除封闭液并滴加ET-1、nNOS和eNOS一抗液，4℃过夜。PBS清洗，滴加通用型二抗（山羊抗鼠IgG-HRP），室温孵育30 min。PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶（三抗），室温孵育30 min。PBS冲洗，DAB显色，苏木素染色，氨水返蓝，盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片。结果采用量化评分方法，细胞中的染色密度分别赋予分值:0(阴性)，1(弱阳性)，2(中阳性)，3(强阳性)，染色范围分别赋予分值:0(＜5%)，1(5%～25%)，2(26%～50%)，3(51%～75%)，4(＞75%)。每个样本的免疫组化量化结果=1×(%弱阳性)+2×(%中阳性)+3×(%强阳性)，因此量化结果在0(无免疫反应)到300(最大免疫反应)之间。

（七）蛋白免疫印迹法检测

取冻存阴茎组织约100mg，剪碎，加RIPA裂解液，冰上裂解，4℃，12000rpm离心15min，BCA法检测蛋白浓度，变性。取200μg于12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中250mA恒流电泳至分离胶底端;恒定电压、4℃转至PVDF膜上，封闭1 h。一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜后山羊抗小鼠荧光二抗室温孵育2h；内参GAPDH一抗4℃孵育过夜，山羊抗兔荧光二抗室温孵育2h，再次洗膜后分别于Quantity One系统进行灰度扫描，采用ImageJ软件分析，以目的蛋白／GAPDH条带吸光度值作为蛋白表达强度。

三、统计学分析

采用SPSS22.0统计软件进行分析，计量资料用以x±S表示，多组数据做正态检验和方差齐性检验，满足条件，采用单因素方差分析（ANOVA），如不满足条件，求出秩次进行方差分析，检验水准α＝0.05。P＜0.05有统计学意义。

结 果

一、免疫组化检测结果

（一）ET-1在各组大鼠阴茎组织中的表达结果

ET-1主要表达在大鼠阴茎海绵体窦及血管内皮细胞的细胞胞核和胞浆中,阳性表达呈棕黄色胞核及淡黄色胞浆。图1可见，ET-1在各组大鼠阴茎组织中均有表达，其中在ED组表达量较N组显著升高（P＜0.05）。干预后，WE、COE和Yimusake组的表达量较ED组显著降低（P＜0.05），同时WE和COE组与N组之间无显著差异（P＞0.05），且低于AE和Yimusake组（P＜0.05），见图1，表1。

图1 各组大鼠阴茎组织ET-1免疫组化结果（×400）

表1 各组大鼠阴茎组织中ET-1、nNOS、eNOS的表达量（x±S）

（二）eNOS在各组大鼠阴茎组织中的表达结果

eNOS主要表达在阴茎海绵体血管、海绵窦内皮细胞的细胞浆中，细胞核中亦有表达，阳性表达呈棕黄色。图2结果显示，eNOS在各组大鼠阴茎组织中均有表达，其中ED组的表达量较N组显著降低（P＜0.05）。干预后，AE、WE、COE和Yimusake组的表达量均较ED组显著升高（P＜0.05），并显著高于N组（P＜0.05），各干预组之间则无显著性差异（P＞0.05），见图2，表1。

图2 各组大鼠阴茎组织eNOS免疫组化结果（×400）

（三）nNOS在各组大鼠阴茎组织中的表达结果

nNOS主要表达在海绵体平滑肌及血管壁、海绵窦内皮细胞的细胞浆中，细胞核中亦有表达，阳性表达呈棕黄色。由图3可见，nNOS在各组大鼠阴茎组织中均有表达，其中，ED组的表达量较N组显著降低（P＜0.05）。干预后，AE、WE、COE和Yimusake组均较ED组显著升高（P＜0.05），同时可见，COE组显著高于WE和N组（P＜0.05），并与Yimusake和AE组间无显著性差异（P＞0.05），见图3，表1。

图3 各组大鼠阴茎组织nNOS免疫组化结果（×400）

二、免疫印迹检测结果

在24KD、155KD和140KD附近分别检测出ET-1、nNOS和eNOS各亚型特异性条带，以GAPDH作为内参，采用软件定量分析ET-l、eNOS和nNOS的蛋白表达。结果如下：

（一）ET-1在各组大鼠阴茎组织中的表达结果

如图4所示，ET-1在ED组的表达较N组显著升高（P＜0.001），干预后，COE和WE组较ED组显著降低（P＜0.001），同时也显著低于AE组（＜0.001），且与N组之间无显著性差异（P＞0.05）。Yimusake和AE组与ED组之间无显著性差异（P＞0.05），同时显著高于N组（P＜0.001），见图4。

图4 ET-1在各组大鼠阴茎组织中的表达

（二）eNOS在各组大鼠阴茎组织中的表达结果

如图5所示，eNOS在ED组的表达量较N组显著降低（P＜0.001），经干预后，COE、AE和Yimusake组较ED组显著升高（P＜0.001），并且COE、AE和Yimusake组显著高于N组（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），同时三组之间无显著性差异（P＞0.05）。WE组显著高于ED组，并与N组之间无显著性差异（P＞0.05），见图5。

图5 eNOS在各组大鼠阴茎组织中的表达

（三）nNOS在各组大鼠阴茎组织中的表达结果

如图6所示，nNOS在ED组的表达量较N组显著降低（P＜0.001），经干预后，COE、AE和Yimusake组较ED组显著升高（P＜0.001），并显著高于N组（P＜0.001），同时三组之间无显著性差异（P＞0.05），而WE组与ED组之间比较，无显著性差异（P＞0.05），见图6。

图6 nNOS在各组大鼠阴茎组织中的表达

讨 论

ED作为男科常见疾病，病因很多且较复杂，据流行病学调查显示[7]，与ED发病有关的因素包括糖尿病、心血管疾病、肥胖、泌尿系统疾病和精神疾病等，同时，围绕上述病因所导致的ED方面的研究也相对较多，但是关于环境激素和冷刺激对男性阴茎勃起功能影响的研究较少，故前期工作中，我们以冷刺激联合环境雌激素样饲料复合干预的方法建立了复合应激性ED大鼠模型，在对该模型进行综合评价的基础上，对其行为学与神经内分泌免疫网络改变进行过报道[3,8]，随后，运用蛋白质组学技术，对该模型伊木萨克片干预前后阴茎组织差异表达蛋白及伊木萨克片的调控作用进行了生物信息学分析与报道，得出阴茎组织中血管内皮及平滑肌功能改变可能是复合应激性ED发生发展的关键机制，并与炎症相关，初步确定MAP1、BGN等候选蛋白标志物和伊木萨克片药物干预的蛋白靶点，但具体的机制尚有待于进一步研究[9]。

阴茎勃起是神经内分泌调节下的一系列血管平滑肌舒张反应，其中血管内皮发挥着关键性的作用。中枢和外周神经以及阴茎海绵体内窦隙及血管内皮细胞产生和释放一些舒张与收缩因子，二者之间的平衡对平滑肌状态有重要影响[10]。ET-1是目前发现的最强的血管收缩因子之一，主要由血管内皮细胞产生，对于血管具有较强的促进收缩及促进血管平滑肌增殖的作用,且在促进血管平滑肌细胞的增殖分裂的同时,能介导各种平滑肌收缩，包括海绵体平滑肌、尿道海绵体平滑肌等[11]，因此，血管功能异常致ET-1水平升高在ED的病理生理机制中有着重要的作用。而一氧化氮（Nitric Oxide，NO）则是分布在阴茎的副交感和非肾上腺素非乙酰胆碱能神经末梢、血管和阴茎海绵体窦内皮细胞在NOS催化下释放的一种可溶性气体分子，为主要的舒血管因子，在激活NO-cGMP通路，诱发阴茎勃起中发挥着关键性的作用。本研究结果中免疫组化和免疫印迹结果均显示，该ED模型阴茎组织中ET-1的表达量较N组显著升高，而eNOS和nNOS则显著降低，结果提示，内皮功能受损，并导致ET-1表达升高和NO产生减少可能是复合应激条件下导致ED发生的重要病理机制之一。具体而言，可能和ET-1表达增加，从而进一步激活ETA和ETB受体，并使细胞加速Ca2+内流，导致海绵体平滑肌持续性收缩，血流减少有关。同时，eNOS及nNOS表达降低，导致NO生成减少，平滑肌细胞舒张功能减退，进而产生ED。至于两者之间是否相互影响，产生协同效应，尚需进一步研究，但有文献报道[12,13]，ET-1可通过与阴茎组织上的特异性受体结合，加速Ca2+内流，并影响NO的生成，导致阴茎海绵体持续性收缩的同时，还能抑制内皮NO的生物利用度，促进阴茎动脉的收缩，并进而导致ED。

经伊木萨克片和伊木萨克不同提取物及组合物干预后，结果显示，COE、WE和Yimusake组中ET-1的表达较ED组均显著降低，同时COE和WE组与N组之间无显著差异，且显著低于AE和Yimusake组。提示，COE、WE和伊木萨克片均可通过降低ET-1发挥治疗作用，同时COE和WE较AE和伊木萨克片而言调控ET-1效果更显著。COE、AE和Yimusake组中eNOS及nNOS表达均较ED组显著升高，并显著高于N组，同时COE组nNOS表达亦显著高于Yimusake组，该结果提示，COE、AE和伊木萨克片均可通过升高eNOS和nNOS表达来发挥治疗作用，具体可能和进一步激活NO-cGMP通路相关，同时也表明COE调控nNOS的效果优于伊木萨克片。

综上所述，在复合应激性ED的发生发展中，从阴茎这一效应器官角度而言，阴茎组织中ET-1和eNOS、nNOS表达改变可能是关键病理学机制，结合以往的研究，我们认为具体原因可能和复合应激条件下产生慢性炎症，并进一步引发内皮细胞功能改变有关，但需进一步研究证实。伊木萨克提取物及其组合物，以及伊木萨克片可通过调控ET-1与nNOS、eNOS表达水平来发挥治疗作用，经综合分析，COE的整体调控作用优于伊木萨克片，该结果为伊木萨克的二次研发奠定了基础。