基于RNA测序研究雄激素对人包皮成纤维细胞基因表达的影响*

薛竞东 俞仲伟 冯 超 谢 弘 李 锋 王田龙 汪祖林**

1.上海市第八人民医院（上海市第六人民医院徐汇分院）泌尿外科（上海 200235）2.上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科（上海 200233）

下泌尿道纤维化，尤其是膀胱颈部纤维化、尿道狭窄、阴茎海绵体硬结症等在治疗上较为棘手，技术要求高，术后复发率较高，所以对相关疾病发生的病因机制研究在临床上是急需解决的课题之一。临床上治疗处理集中在改变大体解剖结构层面，虽技术和方法不断更新[1-2]，但疗效往往不令人满意，且疾病容易复发，究其原因主要是目前研究集中在组织工程修复，而对相关疾病本身发生、发展机制认识尚无明确定论，缺乏有效的措施防止疾病发生以及阻止术后复发。目前有研究认为雄激素参与心血管纤维化、肺纤维化等病理进展[3-4]。在泌尿系统相关疤痕纤维化形成过程中，主要为成纤维细胞等参与的过度修复造成，而在其中微环境中高雄激素可能扮演重要的角色。本研究拟通过目前较为热门的转录组测序技术深度分析雄激素处理人包皮成纤维细胞后差异性表达变化及其相关信号通路的影响。

材料与方法

一、主要细胞系及试剂

人包皮成纤维细胞系HFF-1细胞购自中科院细胞干细胞库；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol试剂盒购自上海普飞公司、M-MLV试剂盒购自美国promega公司。

二、细胞培养

将细胞用含15%胎牛血清，1%双抗（青链霉素混合液）的DMEM高糖培养液，置于37℃，5%CO2的培养箱中进行培养。显微镜下观察97H细胞为贴壁细胞，台盼蓝染色活细胞率达95%以上。将对数生长期的HFF-1细胞用胰酶消化后以50万细胞/孔的密度接入细胞培养皿内，贴壁培养24小时后，吸弃原有培养基，贴壁的HFF-1用于后续实验。

三、R NA提取和测序

HFF-1接种于6孔板中，实验分为两组：加等体积浓度0.5%乙醇（control组，下称Ctrl组）与等体积含浓度0.5%乙醇的80nmol/L双氢睾酮处理（drug组，下称Drug组），每组3个复孔，6h后收集细胞，Trizol法提取总RNA，并进行质量控制。按照美国Illumina生物技术公司RNA-seq样本制备试剂盒说明构建cDNA文库。对照基因组信息和完整的转录组信息，将测序出的reads比对到参考基因组上，进而对基因或转录本进行注释和定量。将reads比对到基因组后，采用StringTie（2016）对表达进行注释和定量。StringTie应用网络流算法和可选的基因组denovo组装，将复杂的数据集组装成转录本。进一步计算基因和转录本的FPKM值（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragment，即每百万外显子片段碱基映射获得的基因表达）。

四、差异转录本分析

利用Ballgown对两个不同处理组进行比较，得到P值、Q值和转录本间的差异倍数（fold-change）；本研究中将两组进行比较，进行差异基因筛选，筛选条件为P＜0.05和Fold change＞1.5倍及＜0.66667倍。

五、GO功能类别及通路富集分析

GO数据库（gene ontology）用树状分层的方式对基因及蛋白功能进行详细描述，阐明了基因功能之间的层次关系。并将基因功能分为：分子功能（MF；molecular function）、生物学过程（BP；biological pathway）和细胞成分（CC；cellular component）3个类别。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系统分析基因及其编码产物间关系、基因功能、基因组信息的数据库，信号通路分析（Pathway分析）是基于KEGG数据库，对差异基因利用Fisher精确检验和检验，将目标基因参与的通路进行统计学分析，按照P＜0.05进行筛选，筛选出显著性差异的信号通路。

六、定量PCR验证

将测序的RNA样本逆转录为cDNA，通过对测序结果中代表性的差异表达基因（GJA1、JUN、SMAD3、KRT18）进行定量PCR验证，通过验证发现4个基因进行定量PCR验证，定量PCR使用SYBR Premix ExTaq进行分析，目的基因的mRNA表达量均以β-actin作为内参，用2-△△Ct最小二乘法进行计算。每个样本重复3个复孔，每次实验均重复3次以上，以保证结果的稳定性。

七、统计学处理

采用Graphpad 7.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用配对t检验，P＜0.05定义为差异有统计学意义。

结 果

一、RNA-seq聚类分析结果

由基因火山图（图1）可直观展示每个比较组合的差异基因分布情况，通过对两个处理组进行比较，得到26573个基因无差异化表达，688个差异表达基因，其中上调表达基因414个，下调表达基因274个。图中横坐标表示基因在两组中的表达倍数变化值（log2Fold-Change值），纵坐标表示基因在两组中表达差异的显著性水平(-log10padj)，数值越大，差异性越明显。

图1 基因火山图

二、差异基因显著富集的GO分析结果

根据分析结果中差异基因的显著性水平构建分布图（图2），可见在分子功能（BP）、生物学过程（CC）和细胞成分（MF）3个类别基因中，显著改变功能基因主要富集于：细胞外基质结构及细胞外成分、血管新生；细胞迁移及运动的正调控脉管系统发育的调节；胶原代谢过程、低氧反应、细胞-基质粘附；上皮细胞增殖迁移、伤口愈合等。

图2 GO富集分析柱状图

三、差异表达基因的通路显著性富集分析结果

由图3可见，通过KEGG数据库分析，上调基因明显富集于细胞外基质相关及细胞增殖、凋亡、迁移的信号通路：黏着斑（Focal adhesion）通路、细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction）通路、PI3K/AKT信号通路、Wnt信号通路、Ras信号通路等，此外还与趋化因子信号通路、补体途经（Complement and coagulation cascades）、肌动蛋白细胞骨架的调节信号通路有关，说明雄激素刺激成纤维细胞后可导致细胞外基质信号及炎症信号通路发生改变。

图3 KEGG富集分析柱状图

四、定量PCR验证结果

由图4可见，通过对测序结果中代表性的差异表达基因 （GJA1、JUN、SMAD3、KRT18）进行定量PCR验证，发现4个基因的表达趋势与测序结果完全一致，睾酮处理成纤维细胞后能显著抑制GJA1和JUN基因的表达，显著增强SMAD3和KRT18基因的表达，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图4 各基因qPCR验证表达散点图

讨 论

泌尿系统组织、器官纤维化，尤其是尿道狭窄纤维疤痕化的临床基础研究较为热门，但其病理机制研究仍相对薄弱，基于目前的研究，多数学者认为其主要病理机制为成纤维细胞、细胞因子和细胞外基质之间相互作用，并通过多种细胞因子以及趋化因子参与发挥作用，调控着成纤维细胞的增殖与代谢，延缓上皮细胞的修复重建，影响细胞外基质的形成与降解，最终导致创面过度修复，产生增生性瘢痕，进而破坏原组织完整性，造成疤痕的形成[5]。目前针对该种疾病的研究暂无特定的对应细胞系，多数研究者均采用临床获取的尿道等疤痕组织分离纯化的成纤维细胞原代培养后进行基础实验，缺乏一定的可重复性的实验原则，鉴于上述考量，结合目前研究报道情况，选用靠近尿道组织的较为成熟的人包皮成纤维细胞系（HFF-1）作为实验对象[6]。

睾酮是雄性动物体内最主要的雄性激素。多项研究证实睾酮对血管活性物质、炎症因子等均有不同程度的影响。Foresta等[3]研究证实睾酮可通过雄激素受体途径促进骨髓内皮祖细胞的迁移与增殖，进而减少动脉硬化疾病的发展。另有报道睾酮可以通过ERK1/2通路影响心肌成纤维细胞的胶原合成和增殖过程[7]。最新的研究显示在前列腺肿瘤领域内，肿瘤相关成纤维细胞通过胞膜雄激素受体途径调控分泌干扰素等细胞因子参与并影响周围肿瘤干细胞活性[8]。在一项回顾性研究中，从1200例接受尿道成形术的患者选取11例典型病例，将他们分为正常雄激素组和低雄激素组，结果发现两组中低雄组患者术中取得的尿道狭窄疤痕组织的雄激素受体更低，而尿道萎缩坏死率更高，这可能与组织血管化程度低下、缺氧程度高有一定的关系[9]。虽雄激素及其受体在男科领域研究较为普及，多数应用于前列腺增生及前列腺肿瘤的治疗方案上，但其在泌尿生殖器官纤维化领域，尤其是男性尿道狭窄疤痕形成，海绵体纤维化，阴茎硬结症等方面机制机理研究目前仍较少涉及。

RNA高通量测序技术又称为转录组测序技术，通过高通量测序手段检测细胞内mRNA水平[10]。测序的流程大致为提取总RNA，根据不同的样本进行RNA片段化，再反转录得到cDNA后通过接头连接和PCR扩增进行高通量的测序，通过评估得出基因组的表达丰度，并进行差异基因表达分析，通过生信软件GO分析和KEGG分析进行差异基因分门分类，得出相关信号通路。目前该项技术已经越来越多地应用于临床和基础研究，尤其在肿瘤领域应用广泛[11-12]。

我们的研究通过RNA测序技术检测了雄激素对HFF-1细胞引起的基因表达改变的影响，根据RNA-seq结果可以发现，雄激素处理后能够显著降低相关纤维化保护性基因的表达，上调细胞外基质相关及细胞增殖炎症基因表达，改变细胞外基质成分和结构分布，调节成纤维细胞迁移能力及其分泌胶原蛋白的细胞功能。在本实验生信分析中发现雄激素处理后黏着斑（Focal adhesion）通路、细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction）通路、PI3K/AKT信号通路、Wnt信号通路等均发生明显变化，这些经典通路可能参与了细胞纤维化的整个过程。以GJA1，JUN基因为代表的相关通路基因在雄激素处理组中表达显著下降，这可能是纤维化病理过程中细胞外基质和结构紊乱，细胞凋亡信号失调的原因之一，说明高雄激素的环境影响可以打乱正常的修复过程，进而导致疤痕进展的重要因素。此外，雄激素能够显著增加SAMD3，KRT18基因的表达，我们推测这可能是造成成纤维细胞的过度聚集和过度角化病变的潜在原因[13-15]。

本研究结果对于揭示雄激素的作用机制和作用靶点，以及对成纤维细胞基因表达的影响提供了系统性的实验基础，可能为后续泌尿系统纤维化尤其是尿道形成疤痕病理机制提供一定的理论依据。在后续的研究过程中，我们将进一步研究纤维化过程中各个相关基因通路的相关性及相互作用，对于该问题的深入分析，有望发现尿道疤痕形成中的关键问题，为进一步明确尿道狭窄疾病发生发展机制，并为后期疾病的预防工作新思路、新策略打下基础。