疏水性低共熔溶剂液液微萃取/高效液相色谱法测定豆奶中三嗪类和苯脲类除草剂

朱 清，龙冰华，陈星航，闫 徐，朱红年，冯 吉，徐尉力，王志兵

（长春工业大学 化学与生命科学学院，吉林 长春 130012）

豆奶是人们常饮用的一种豆类作物制品［1］，具有口感细腻、香味浓郁、营养丰富等特点，深受大众喜爱。随着农业技术的发展，培育优质农作物离不开除草剂的使用。三嗪类和苯脲类除草剂是农业中两类重要的除草剂，两者均是通过抑制植物的光合作用而控制杂草，常被用于豆科作物田间杂草的防治［2－3］。但这两类除草剂具有较好的稳定性，水溶性和较高的致癌风险［4］，极易通过生物富集作用残存于水稻［5］、小麦［6－7］和大豆［8］中，直接或间接地对人体健康构成威胁。因此，建立一种操作简单、快速高效的检测豆奶中三嗪类和苯脲类除草剂残留的方法尤为重要。目前，食品中三嗪类和苯脲类除草剂常用的检测方法有高效液相色谱－质谱法［9－10］、毛细管电泳法［11］、气相色谱法［12－13］以及高效液相色谱法［14－15］等。其中高效液相色谱法具有灵敏度高、分离效率高、分析速度快、操作简单快速、成本低等优点，常被用于食品中农药残留的分离与检测。

由于食品基质复杂，目标物含量低，在分析前通常需对样品进行前处理。因此，各种样品前处理方法应运而生，如固相萃取法［16－17］、QuEChERS 法［18］、液液萃取法［19］、基质固相分散法［20］和液液微萃取法［21］等。其中，液液微萃取法是在液液萃取法基础上发展而来的一类新型萃取方法，具有溶剂用量少、操作简单、富集效率高、成本低等特点［22－23］，常被用于农残分析检测。然而，液液微萃取法常以有机试剂作为萃取剂，对实验人员和环境具有一定的危害性，且有些是亲水性萃取剂，往往需通过旋蒸、氮吹等方式实现目标物的富集，从而增加了实验操作的复杂性和难度。

低共熔溶剂（DES）是一类由氢键供体和氢键受体依靠二者之间的氢键作用，按照一定化学计量比形成的两组分或三组分低共熔混合物［24］。DES 作为一种新兴的绿色溶剂，与传统有机溶剂相比，具有低挥发性、易合成、环境友好、易生物降解、不污染环境等优点［25－26］，在液液微萃取中常作为萃取溶剂用于生物［27］、食品［28］和环境［29］样品中农药残留的萃取。然而，目前常用于萃取分离领域的大多是亲水性DES［30］，使其在含水样品目标物提取中的应用受到限制。2015 年，Osch 等［31］首次开发了疏水性DES，并成功地将其用于从水溶液中回收挥发性脂肪酸。但由于不同组分、不同配比的DES 具有不同性能，且温度对其萃取性能有一定影响，导致其应用受限。

本研究以四丁基氯化铵为氢键受体，六氟异丙醇为氢键供体，通过加热磁力搅拌的方法合成了一种新型疏水性DES，并将其作为萃取剂，通过液液微萃取法对豆奶中的4 种除草剂（阿特拉津、去草净、灭草隆和绿麦隆）进行萃取，同时结合高效液相色谱（HPLC）对目标物进行检测，并进行了提取条件优化和分析方法评价。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1100型高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器）、Zorbax SB－C18色谱柱（150 mm×4.6 mm×3.5 μm）和C18预柱（7.5 mm × 2.1 mm × 5 μm）购于美国Agilent 公司；AG 5428 型台式高速冷冻离心机（i国Eppendorf 公司）；BT100S 型蠕动泵（上海笃特科仪器有限公司）；XW－80A 旋涡混合器（上海米青科实业有限公司）；KQ－100DE超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）。

三嗪类和苯脲类除草剂标准品：阿特拉津、去草净、灭草隆和绿麦隆（纯度均＞99.5%，阿拉丁试剂公司）；中性氧化铝（200～300 目，pH：6.5～7.5），购自中国药品生物制品检定所；乙腈、甲醇和六氟异丙醇（色谱纯，科隆化学品有限公司）；四丁基氯化铵（上海成捷化学有限公司）；其他试剂均为分析纯，购自北京化工厂。

不同品牌的市售包装豆奶（按品牌不同编号样品1～4），均购于长春市当地超市。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 分别准确称取4种除草剂标准品各5 mg于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，混匀后得到500 μg/mL的标准储备液，于4 ℃避光保存，备用。后续实验所用工作溶液均由各标准储备液经乙腈稀释得到。

1.2.2 低共熔溶剂的制备 以四丁基氯化铵为氢键受体，六氟异丙醇为氢键供体合成DES，将受体与供体分别按摩尔比为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（依次记为DES－1、DES－2、DES－3、DES－4、DES－5）加至烧杯中，将烧杯置于60 ℃水浴以5 000 r/min 磁力搅拌，直至形成均匀透明的液体，DES合成完毕，冷却后在40 ℃下密封保存。

1.2.3 样品前处理 在课题组前期研究［32］基础上进行适当改进，对市售包装豆奶进行除蛋白和净化处理。

三氯乙酸除蛋白：取9 mL 样品于10 mL 离心管中，加入1 mL 100 g/L 的三氯乙酸溶液，振摇1 min，将离心管以7 000 r/min离心5 min，取出全部上清液备用。

净化：取2.00 g 中性氧化铝置于上下垫有脱脂棉的10 mL 一次性注射器中，在蠕动泵的辅助下（10 mL/min）对上述上清液进行净化，收集6 mL 作为净化后样品溶液，用于后续实验。除“2.2.3”实际样品分析外，其余实验结果均由样品1（某品牌市售包装豆奶样品）获得。

1.2.4 低共熔溶剂液液微萃取 萃取流程如图1所示，首先取6 mL净化后样品溶液置于10 mL离心管中，向其中加入200 μL DES和0.4 g NaCl，涡旋3 min，使DES和样液充分接触，涡旋后DES在试管底部迅速聚集，形成两相体系，将其在2 000 r/min条件下离心3 min，使富集目标物的DES和样液充分分离。取200 μL下相用100 μL乙腈回溶后，过0.22 μm有机滤头，滤液注入系统进行HPLC分析。

图1 低共熔溶剂液液微萃取流程图Fig.1 Flow chart of liquid－liquid microextraction with deep eutectic solvents

1.2.5 色谱条件 流动相：由水（A）和乙腈（B）组成，洗脱梯度条件为：0～20 min，50%～55% B；20～25 min，55%～60% B；25～30 min，60%～55% B；30～35 min，55% B。流动相流速为0.5 mL/min，进样体积为20 μL，柱温为30 ℃，三嗪类和苯脲类除草剂的检测波长分别为222 nm和245 nm。

1.3 数据处理

通过Excel 软件对萃取条件优化与方法学的数据进行统计分析，并通过Origin 2017 软件进行作图和数据拟合。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

2.1.1 DES 种类的影响 液液微萃取技术中萃取溶剂必须对目标物具有一定的溶解性。考察了按“1.2.2”方法合成的DES（DES－1、DES－2、DES－3、DES－4、DES－5）对目标物回收率的影响。如图2 所示，选用DES－3时各目标物的回收率最高，即受体与供体摩尔比为1∶1 时，所制备的DES 对目标物的萃取效果最佳。这可能是由于该摩尔比条件下，合成的DES 氢键作用力强，粘度低，流动性大，更易分散于溶液中，进而提高对目标物的萃取效率。因此，本研究选用DES－3作为萃取剂。

图2 DES种类对4种目标物回收率的影响Fig.2 Effect of DES types on recoveries of 4 analytes

2.1.2 DES 用量的影响 考察了DES 用量（100、200、300、400、500 μL）对4 种目标物回收率的影响。结果显示，当DES 的用量在100～200 μL 范围时，各目标物回收率随着DES 用量的增加而增大，当DES用量为200 μL时回收率最大；继续增加DES用量，目标物的回收率总体呈下降趋势。这可能是因为增加DES 的用量，增强了DES 对目标物的溶解能力所致。而继续加入DES，导致DES 粘度变大，传质效能降低使得目标物残留在水相中，影响DES 相和水相的分离，并且一部分水进入DES 相中导致目标物的浓度降低，使萃取效率下降。因此，本实验选择DES用量为200 μL。

2.1.3 NaCl 用量的影响 NaCl 的加入可增加样液的离子强度，同时减少目标物在水相中的溶解度，从而更好地被萃取剂富集，提高目标物的回收率。考察了NaCl 用量（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0 g）对目标物回收率的影响。结果表明，NaCl的加入可明显提高目标物的回收率，NaCl用量在0～0.3 g时，4种目标物的回收率随NaCl用量的增加呈上升趋势；NaCl用量增至0.4 g时，除了去草净的回收率略有下降外，其余3 种目标物的回收率达到最大值。这主要是因为NaCl的加入量较小时，盐析效应起主导作用，降低了目标物在水中的溶解度，提高了目标物回收率。但NaCl 用量继续增加时，目标物的回收率反而降低，这可能是因为过量的盐会增大样液的粘性，抑制DES 分散，从而降低了DES和样液间的传质效率。因此，本实验选择NaCl用量为0.4 g。

2.1.4 涡旋时间的影响 涡旋可使疏水性DES分散在水中。考察了涡旋时间（0、1、2、3、4、5、6、7、8 min）对目标物回收率的影响，发现随着涡旋时间的增加，目标物的回收率显著增加。当涡旋时间为3 min 时，阿特拉津的回收率略有下降，其他3 种目标物的回收率达到最大值。这是由于涡旋促使DES 分散成细小的液滴并均匀分散在水中，增大了DES 与目标物的接触面积，更有利于富集目标物。但继续增加涡旋时间，目标物的回收率有所下降，这可能是因为长时间剧烈涡旋导致DES 不易团聚，也可能是破坏了部分DES 之间的氢键，导致萃取效果不佳。因此，为缩短实验时间和提高萃取效果，实验选择涡旋时间为3 min。

2.1.5 pH 值的影响 pH 值会影响样液中蛋白质和目标物的存在状态，当pH 值由酸性变为碱性时，样品溶液由无色变为黄绿色，部分酸性蛋白达到等电点而析出，对目标物有一定的吸附作用，从而影响目标物的回收率。实验考察了不同pH 值对目标物回收率的影响（如图3）。结果显示，当pH 值为6.0 时，4 种目标物的回收率整体达到较大值；而当pH 值为7.0 时，去草净的回收率略有下降，其余3种目标物的回收率均略有提高。经过方差统计分析，采用t检验法检验在pH 6.0和pH 7.0 时的回收率无显著性差异。由于样品前处理后样液的pH 值约为6.0，为简化操作步骤，实验选择最佳pH值为6.0。

图3 pH值对4种目标物回收率的影响Fig.3 Effect of pH value on recoveries of 4 analytes

2.1.6 温度的影响 改变样液的温度，可能会影响各组分的溶解速度以及DES和样液的传质过程。实验考察了样液温度（0、15、25、30、35、40 ℃）对目标物回收率的影响，结果表明温度对目标物萃取效果的影响不明显。为简化实验步骤，本实验选择在室温下操作。

2.2 方法评价

2.2.1 线性关系、检出限与定量下限 配制含有4 种目标物的混合标准溶液，用乙腈进行等度稀释后分别加入样品中，制备成系列质量浓度（1.00、5.00、10.00、50.00、100.00、200.00、500.00 μg/L）的加标样品。在最佳实验条件下，按照“1.2.3”和“1.2.4”步骤对目标物进行净化和萃取，以加标质量浓度（ρ，μg/L）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标绘制工作曲线。结果表明，各目标物在1.00～500.00 μg/L 范围内呈良好的线性关系（r≥0.998 4）。分别以11 组低浓度加标样品在信噪比为3 和10 时所能检测的目标物最低质量浓度作为本方法的检出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10），计算得到方法的LOD和LOQ分别为0.56～0.95 μg/L和1.87～3.16 μg/L（如表1）。

表1 目标物的线性关系、检出限和定量下限Table 1 Linear relations，LODs and LOQs for the analytes

2.2.2 精密度 分别在3 个不同加标水平（10.00、25.00、50.00 μg/L）下测定日内和日间相对标准偏差（RSD），以评价方法的精密度。其中，日内RSD 通过在1 d内平行分析6次加标样品得到；日间RSD通过每天分析1 次，连续测定6 d 得到。如表2 所示，日内和日间RSD 分别为0.28%～2.0%和2.1%～7.5%，说明该方法具有良好的精密度。

表2 日内与日间精密度（n=6）Table 2 Intra-day and inter-day precisions for the analytes（n=6）

2.2.3 加标回收率与实际样品分析 为了进一步考察方法的实用性，采用本方法对4种不同品牌的市售包装豆奶样品进行分析，结果表明，样品中均未检出目标物。对上述空白样品进行不同加标浓度（10.00、50.00 μg/L）的回收实验，每个加标样品平行测定3 次，各目标物的回收率为86.4%～117%，RSD为0.13%～5.7%（如表3）。混合标准品和加标样品的液相色谱图如图4所示，可以看出各目标物在保留时间内出峰规律，无重叠，无明显干扰峰，说明该方法可用于豆奶中4种目标物的分离与测定。

图4 混合标准品（A）和加标样品（B）的色谱图Fig.4 Chromatograms of mixed standards（A）and spiked sample（B）peaks：1.atrazine，2.terbutryn，3.monuron，4.chlortoluron

表3 实际样品的回收率与相对标准偏差（n=3）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of actual samples（n=3）

2.3 方法比较

本方法与文献方法的比较如表4 所示。相较于离子液体基质固相萃取法（MSPD－IL），本法采用DES 代替传统的有机溶剂作萃取剂，具有回收率高、检出限低、环境友好等优点。与离子液体液液微萃取法（DLLME－IL）相比，本法具有萃取效率高、萃取剂用量少等特点。本研究将DES 液液微萃取（DLLME－DES）与高效液相色谱法相结合，通过涡旋、离心等辅助手段，使提取过程更简单、高效，检出限更低。因此，相对于基质固相萃取（MSPD）、固相萃取（SPE）等方法，本方法在萃取溶剂的绿色安全性、操作的简便性以及方法高效性方面具有一定优势。

表4 本方法与文献方法的比较Table 4 Comparison between the proposed method and other methods

3 结 论

本研究用六氟异丙醇和四丁基氯化铵按照1∶1的摩尔比合成了一种新型的疏水性低共熔溶剂，并将其作为萃取溶剂，通过液液微萃取法对不同种类市售包装豆奶中的4 种三嗪类和苯脲类除草剂残留进行提取与富集，结合高效液相色谱法进行检测。研究表明，以新合成的低共熔溶剂代替传统有机溶剂作为萃取剂，更加绿色、环保。该方法具有检出限低、萃取时间短、成本低等特点，可为其他除草剂残留的分析与检测提供参考依据。