黔产椭圆叶花锚HPLC指纹图谱研究

何 羽 熊灿琼

贵州省毕节市市场监督管理局检验检测中心，贵州 毕节 551700

椭圆叶花锚为龙胆科植物椭圆叶花锚HaleniaellipticaD.Don的干燥全草。为我省少数民族用药，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003 版)，贵州习称黑耳草[1]、阿小根、龙胆、青鱼胆、肝炎药、黑节苦草、鸡脚莲、花锚、甲地然果、四棱草、小儿肿消、花脸锚等。据文献记载[2-3]，我国花锚植物共2种1变种，即椭圆叶花锚HaleniaellipticaD.Don(包括原变种卵萼花锚H.ellipticavar.elliptica及变种大花花锚H.ellipticavar.grandiflora)和花锚H.corniculata(Linn)Comaz。花锚H.corniculata(Linn)Comaz主要分布于内蒙东北部、华北地区[8]；椭圆叶花锚HaleniaellipticaD. Don主产于西藏、青海、云南、陕西、甘肃、四川、云南、贵州省等。根文献报道[4-11]：椭圆叶花锚含有多种化学成分，主要有酮类、酮苷类、黄酮苷类、裂环烯醚萜类、三萜类以及甾体类成分。较多文献报道对其中的齐墩果酸进行含量测定[5]，仅测定单一成分的含量，并不能有效的对其质量进行全面评价，因此，本文拟建立HPLC指纹图谱，以便更加全面的评价黔产椭圆叶花锚的质量。

2 方法与结果

2.1 材料

2.1.1 仪器与试药 Waters e2695高效液相色谱仪；AY-120型电子分析天平(日本岛津公司)；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)；乙醇、磷酸为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，试验用水为纯化水；齐墩果酸对照品(中国食品药品检定研究院 批号：110709-201808)。

2.1.2 样品信息 椭圆叶花锚采自贵州省各地区，经贵州省药品检验所中药学专家李杨老师鉴定为为龙胆科植物椭圆叶花锚HaleniaellipticaD. Don，样品除去泥沙，晒干，粉碎，过四号筛，备用。 样品详情见表1。

表1 样品信息

2.2 试验与结果

2.2.1 色谱条件 Camesil C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)；以25%甲醇为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速：1.0 mL；检测波长258 nm，柱温：40 ℃。(见表2)

表2 流动相梯度变化表

2.2.2 对照品溶液的制备 取齐墩果酸对照品对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取椭圆叶花锚细粉1 g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，称定重量，水浴加热回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.45 μm的微孔滤膜，即得。

2.2.4 精密度考察 取同一药材粉末(S1)约1 g，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件进样测定，测得各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD(%)分别为1.05%与1.24%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性考察 取同一药材粉末(S1)6份，每份约1 g，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件进样测定，测得各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD(%)分别为1.59%与1.38%(n=6)，表明本方法的重复性良好。

2.2.6 稳定性考察 取同一药材粉末(S1)约1 g，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件进样测定，于0、2、4、8、12、24、48 h分别依次进样测定，测得各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD(%)分别为1.42%与1.61%，均小于2.0%，达到规定要求，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.2.7 特征峰的确定 根据12批黔产椭圆叶花锚药材的HPLC图谱的测定结果，共分离出23个色谱峰，将样品的HPLC图谱导入“中药色谱指纹图谱相相似度评价系统(2012版)”进行分析，多点校正，时间窗宽度为0.1，对照图谱生成为中位数，生成黔产椭圆叶花锚药材HPLC对照指纹图谱，共指认了14个共有色谱峰。根据齐墩果酸对照品与样品的HPLC色谱图及对应色谱峰的保留时间及UV光谱图进行对比分析，确认12号峰为齐墩果酸峰，且均达到了基线分离，峰信号较强。如图1所示。

图1 HPLC特征色谱图

2.2.8 相似度计算及结果分析 将生成的对照图谱与12批样品的HPLC色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相相似度评价系统(2012版)”进样分析，计算相似度，结果见表3。

表3 12批样品的相似度结果

12批黔产椭圆叶花锚药材的相似度均在0.90以上，说明各品种之间相似度较高，样品质量比较稳定，所建立的HPLC指纹图谱具有一定的代表性与实用性。

2.3 讨论与小结

2.3.1 检测波长的选择 采用Waters PDA检测器在200～400 nm的波长范围内进行全波段扫描，结果在258 nm的波长处时，HPLC色谱图信息量较大，峰形较好，对照品与相邻杂质峰之间均达到基线分离，空白溶液无干扰。

2.3.2 流动相的选择 分别考察了甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸溶液，乙腈-水，乙腈-0.2%磷酸溶液，25%甲醇-乙腈等流动相体系，经反复优化调整后梯度洗脱比例，结果25%甲醇-乙腈做流动时相色谱图分离效果最佳。

2.3.3 样品溶液提取方法选择 样品分别采用不同浓度的甲醇和乙醇作溶剂水浴回流1～3 h不等，经试验发现，甲醇作溶剂时，杂质峰干扰较小，水浴回流2 h，供试品成分提取较完全，色谱峰信息量较大，故选择用甲醇作溶剂，水浴回流2 h进行供试品溶液的制备。

2.3.4 相似度评价 建立HPLC指纹图谱，并对12批样品进行相似度评价，结果12批样品的相似度均在0.90以上，采用龙胆科植物其他属种的药材进行相互验证，结果相似度较低，表明该指纹图谱能系统地阐明黔产椭圆叶花黔锚药材内在的品质特征，以期能为该药材的质量控制提供参考。