红花注射液中蛋白类成分的分离、纯化与细胞致敏性评价

史传林 李方林 丁选胜

（中国药科大学基础医学与临床药学学院，江苏 南京 211198）

红花注射液是由单位药材红花制成的活血化瘀类注射液，对脑血管疾病、冠心病、脉管炎等疾病有良好的疗效[1-2]。随着其广泛的临床应用，国家食品药品监督管理总局多次对红花注射液引发的过敏反应进行通报[3-4]。周彬等[5]从红花注射液中分离出大分子抗原活性杂质，进行豚鼠ASA试验和大鼠PCA试验，结果表明制剂中的残留蛋白或许是引起红花注射液过敏反应发生的主要因素。中药注射剂过敏反应高发的因素之一就是其化学成分复杂，致敏成分不明确，包括红花注射液在内的大部分中药注射剂在上市前进行的研究并不足以预防其过敏反应的发生，因此对红花注射液中的致敏原进行分离、纯化及致敏性研究，是保证其临床安全应用亟需解决的问题之一。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及仪器

1.1.1 主要实验材料 大鼠嗜碱性细胞白血病细胞（RBL-2H3），购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。红花注射液，华润三九（雅安）药业有限公司，批号16030 402001；DEAE-52 树脂，博美生物科技有限公司，批号BQDE52-100g；Sephadex G-100树脂，博美生物科技有限公司，批号PJTG100-100g；彩色预染超低分子量marker，博士德生物工程有限公司，批号12D07A17；山羊抗大鼠二抗（HRP标记），碧云天，批号110917 180229；红花注射液大鼠致敏血清，实验室自制，批号20170511。

1.1.2 主要试验仪器 分析天平（1/10 000），北京赛多利斯仪器系统有限公司，型号BS124S；垂直电泳Bio-Rad系列，美国Bio-Rad；全自动酶标仪，美国Thermo公司，型号Multiskan GO；紫外分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司，型号N4S；化学发光凝胶拍摄仪，上海天能科技有限公司，型号5200Multi。

1.2 实验方法

1.2.1 DEAE-52层析实验[6]预处理好的DEAE-52先用0.02 mol/L的TBS（pH 8.5）洗涤平衡，然后超声波真空脱气20 min备用。层析柱（柱高30 cm，直径3 cm）先用0.02 mol/L的TBS液（pH 8.5）浸润，底部塞入无菌脱脂棉后加入约1 cm的0.02 mol/L TBS（pH 8.5）缓冲液，倾斜层析柱，缓缓倒入搅拌均匀的DEAE-52树脂，进行装柱。平衡层析柱后，用滴管吸取红花注射液沿层析柱壁环绕上样。依次以0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS（pH 8.5）洗脱液各200 mL进行分段梯度洗脱，流速为0.5 mL/min，分管收集洗脱液，5 mL/管。紫外分光光度计检测280 nm处分管收集的洗脱液的吸光度。

1.2.2 Sephadex G-100凝胶层析[7]将预处理好的Sephadex G-100凝胶浆状物进行装柱并平衡。取0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱液蛋白样品，混匀后备用。用移液管加样，使样品沿柱内壁加入，边加边沿柱内壁转动1周，然后移至中心，使样品尽快分布于表面。待样品全部进入床内，用少许0.02 mol/L TBS（pH 8.5）缓冲液冲洗柱内壁和床表面2次，注意不要破坏床表面平整。用0.02 mol/L TBS（pH 8.5）-0.01 mol/mL NaCl缓冲液洗脱5倍柱床体积，洗脱速度为0.25 mL/min。收集洗脱液，每管5 mL。用紫外分光光度计动态检测洗脱液在280 nm处吸光度。

1.2.3 Tricine-SDS-PAGE分析 将红花注射液蛋白成分与Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液（1∶1）混合，沸水煮5 min，冷却后低温保存备用。用移液枪分别吸取处理好的样品30 μL，并在最外侧泳道加入彩色预染超低分子量标准5 μL，加样完毕后，即开始电泳。电泳完毕后剥开胶板，剥去浓缩胶部分，将分离胶取出置于培养皿中，倒入固定液后置水平摇床上固定30 min。将固定液倒出，加入考马斯亮蓝G-250染色液置水平摇床上轻摇1 h染色。倒出染色液，加入脱色液，过夜脱色。观察条带并拍照。

1.2.4 Western Blot分析 预先将合适大小的PVDF膜置于甲醇中活化5 min。待Tricine-SDS-PAGE电泳结束，直接取出凝胶剪切好后，铺好转膜三明治（注意不能有气泡），移入转移槽，加满转移缓冲液，加入冰块后开始转膜，300 mA恒流60 min。转膜完成后，取出PVDF膜，滤纸吸干转移缓冲液，置于封闭液（5% BAS-TBST）至完全将膜覆盖，室温脱色摇床上封闭2 h。待封闭完成后，将一抗（大鼠致敏血清）用5% BSATBST稀释至适当浓度（1∶10）。PVDF膜使用一抗孵育，4 ℃，过夜孵育。一抗孵育完成后，采用TBST漂洗膜3次，每次15 min。洗膜完成后，将羊抗大鼠二抗（HRP标记）稀释（1∶2000），PVDF膜室温孵育1 h，孵育完成后采用TBST漂洗PVDF膜3次，每次15 min，然后采用TBS漂洗PVDF膜1次，15 min。完成免疫反应的PVDF膜采用ECL化学发光试剂进行发光检测。

1.2.5 潜在致敏蛋白的细胞致敏性确证[8-9]将RBL-2H3细胞接种于96孔板（1×105个细胞/孔），接种体积为100 μL，每组设置5个复孔，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h。24 h后，正常血清孔、牛血清白蛋白孔、总酶孔、纯化蛋白孔分别加入制备所得的大鼠致敏血清，总酶孔加入等体积MEM培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h。24 h后，弃培养液，以PBS清洗，去除残余血清。每孔再次分别加入100 μL BSA、纯化蛋白或等体积缓冲液，总酶孔加入100 μL含0.1% TritonX-100以完全溶解细胞，37 ℃孵育1.5 h。1.5 h后，冰浴终止反应，收集培养上清，1000 r/min，4 ℃离心。收集离心后所得上清。采用微板法检测上清中β-氨基己糖苷酶释放率[10]：取96孔板，每孔加入上清液50 μL，基质液50 μL，混匀，37 ℃孵育1h，加入150 μL终止液终止反应，5 min内于405 nm处测定吸光值（A）。β-氨基己糖苷酶释放率计算方法见公式1。

1.3 统计学方法 应用SPSS 22.0软件进行数据分析，运用Graphpad Prism 6软件进行作图。计量资料数据以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（若方差齐，采用Bonferroni检验；若方差不齐，采用Dunnett's T3检验）。P＜0.05认为差异显著。

2 结果

2.1 红花注射液蛋白类成分的DEAE-52树脂洗脱结果 为将红花注射液蛋白类成分根据其与DEAE-52结合能力的强弱逐步洗脱下来，本实验选择NaCl的洗脱浓度为0.00～0.05 mol/L的NaCl-TBS（pH 8.5）进行层析洗脱。红花注射液蛋白类成分的DEAE-52树脂洗脱曲线见图1。由洗脱曲线可见，NaCl-TBS洗脱液中NaCl浓度为0.00 mol/L时，基本无蛋白洗脱；当NaCl-TBS洗脱液中NaCl浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L时，得到5个明显的洗脱峰，分别标注为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，为潜在致敏蛋白组分。

图1 红花注射液蛋白类成分的DEAE-52树脂洗脱曲线

2.2 DEAE-52树脂洗脱成分的Tricine-SDS-PAGE分析结果 将0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱液中的蛋白成分进行Tricine-SDS-PAGE凝胶分析，结果见图2。由图可知，在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱液中均可见明显的蛋白条带影，与图1洗脱曲线显示结果一致，并且蛋白分子量基本分布在4.6～42kD。

图2 DEAE-52树脂洗脱成分的Tricine-SDS-PAGE分析结果

2.3 DEAE-52树脂洗脱成分的Western Blot分析结果 在Tricine-SDS-PAGE分析结果证实在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱液中存在蛋白的基础上，进一步将0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱白成分进行Western blot免疫印迹分析，结果见图3。由图可见，在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱成分中，仅有0.04和0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱液出现免疫印迹反应，各有一条清晰的蛋白条带。由此说明，仅在0.04和0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱液中存在潜在致敏蛋白成分，且致敏蛋白分子量在35～48 KD。

图3 DEAE-52树脂洗脱液Western Blot分析结果

2.4 红花注射液蛋白类成分的Sephadex G-100凝胶层析曲线 将0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱蛋白复溶后，进行Sephadex G-100凝胶层析。每管收集流出液5 mL，共收集200管。用紫外可见分光光度计在280 nm处实时动态检测每管流出液的吸光度A280。0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱蛋白混合样品的Sephadex G-100洗脱曲线见图4。由洗脱曲线可知，0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱蛋白混合样品在经Sephadex G-100凝胶层析后，出现两个洗脱峰，如图标记为A和B。峰A有明显的前沿和拖尾，且有多个肩峰，峰B峰形良好，两侧基本对称。由此提示，峰A分离较差，蛋白分子量较小且相近，峰B分离较好，蛋白成分单一。

图4 0.04、0.05 mol/L洗脱蛋白混合样品的Sephadex G-100凝胶层析曲线

2.5 Sephadex G-100凝胶分离成分的Tricine-SDS-PAGE分析结果 将0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱蛋白混合样品进行Sephadex G-100凝胶层析后，获得峰A和峰B，将其浓缩、透析、干燥后，分别进行Tricine-SDS-PAGE凝胶分析，结果见图5。由图可知，在洗脱峰A中可见一条明显的条带影，分子量集中4.6 kD～17 kD范围内。洗脱峰B则仅有一条清晰的蛋白条带，分子量在26 kD～48 kD。

图5 Sephadex G-100层析洗脱液的Tricine-SDS-PAGE分析结果

2.6 Sephadex G-100凝胶分离成分的Western Blot分析结果 在Tricine-SDS-PAGE分析证实在洗脱峰A和洗脱峰B中存在潜在致敏蛋白成分的基础上，进一步将洗脱峰A和洗脱峰B进行Western blot免疫印迹分析，结果见图6。由图可见，在洗脱峰A和洗脱峰B的潜在致敏蛋白成分中，仅有洗脱峰B出现免疫印迹反应，出现一条清晰的蛋白条带。由此提示，仅在洗脱峰B中存在致敏蛋白成分，且致敏蛋白分子量在35-48 kD之间。

图6 Sephadex G-100层析洗脱液的Western Blot分析结果

2.7 潜在致敏蛋白的细胞致敏性评价结果 通过测定β-氨基己糖苷酶释放率评价Sephadex G-100层析洗脱峰A和洗脱峰B中潜在致敏蛋白成分致RBL-2H3细胞脱颗粒的效果。β-氨基己糖苷酶释放率测定结果见图7。与阴性对照组（10%葡萄糖溶液组）比较，阳性对照组（BSA组）和洗脱峰B蛋白组的β-氨基己糖苷酶释放率均明显升高，有极显著性差异（P＜0.001），而洗脱峰A蛋白组的β-氨基己糖苷酶释放率基本无变化（P＞0.05）。由此提示，洗脱峰B蛋白组分能引起RBL-2H3细胞明显脱颗粒，具有致敏性，说明洗脱峰B中蛋白成分为红花注射液潜在致敏蛋白成分。

图7 潜在致敏蛋白的细胞致敏性评价结果

3 讨论

离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。多肽中氨基酸的带电性决定了蛋白质所带电荷[11]。离子交换层析所用的交换剂是经化学反应引入阳性或阴性离子基团制成的，可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如DEAE-52。在DEAE-52层析柱中，经不同离子强度的TBS（pH 8.5）洗脱液进行洗脱后，在临近离子强度的洗脱液中可能存在残留现象。因此，在本研究中检测到0.04和0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱液中均含有致敏蛋白成分，但二者是否为同一成分，有必要开展进一步分析。凝胶层析，也称分子排阻层析，其分离原理是依据被分离物质的分子量差异。该方法是一种比较温和的分离方法，使用于生物蛋白类的分离[12]。凝胶颗粒是常用的固定相载体，其中各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）最为常用。本实验所用葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）层析的分离依据就是依靠样品分子量的差异，而不依赖于改变流动相的组成。因此，选用单一缓冲液作为洗脱液即可，本实验选择pH 8.5的TBS缓冲液。同时，为了防止凝胶可能对带电荷蛋白质的吸附作用，在缓冲液中需要含有一定离子强度的盐，对蛋白质起到稳定和保护作用，因此，本实验中选择用0.01 mol/mL NaCl提供洗脱液所需的离子强度[13]。将含有潜在致敏蛋白的0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脱蛋白样品进一步通过Sephadex G-100凝胶层析，得到一个无拖尾的对称峰B，并通过Tricine-SDS-PAGE 凝胶分析和Western Blot免疫印迹分析，证实洗脱峰B为致敏蛋白成分，其分子量在35～48 kD。该方法操作简单，节省时间，能更好保持蛋白的性质，可用于目标蛋白的纯化和富集。组胺是脱颗粒反应最典型的标志物，但它极不稳定（半衰期为30～60 min），温度和孵育时间变化均可影响含量测定，而β-氨基己糖苷酶稳定性好，释放率与肥大细胞脱颗粒程度一致，与组胺释放率成正相关，作为肥大细胞脱颗粒标志物重复性更好[14-15]。因此，通常测定β-氨基己糖苷酶释放率来反映细胞脱颗粒作用。实验结果表明洗脱峰B蛋白能引起β-氨基己糖苷酶释放率显著升高，验证了洗脱峰B蛋白的致敏性。综上所述，红花注射液中潜在致敏蛋白成分为洗脱峰B中的蛋白成分，其分子量在35～48 kD。这一研究结果将为红花注射液制剂生产中去除或降低致敏原提供理论依据，从而降低红花注射液临床应用过敏反应发生风险，提高其临床应用安全性。