GSTA1基因多态性与白消安为基础预处理方案致急性肝损伤的相关性研究

余慧玲 林升禄 吴雪梅

（1 福建省老年医院药剂科，福建 福州 350001；2 福建医科大学附属协和医院药学部，福建 福州 350001）

白消安（Busulfan）联合环磷酰胺、氟达拉滨等以白消安为基础的预处理方案广泛应用于造血干细胞移植（haematopoietic stem cell transplantation，HSCT）前的预处理过程。白消安作为细胞周期非特异性的双功能烷化剂，治疗窗窄，对体内正常细胞损伤也很大，容易发生急慢性肝损伤等不良反应，更严重的如肝静脉闭塞症（hepatic veno-occlusive disease，HVOD）则可能致命[1]。白消安主要在肝脏内经谷胱甘肽硫转移酶（glutathiones transferases，GSTs）催化与谷胱甘肽结合后代谢[2]。而GSTA1是肝脏GST酶家族中含量最多的一种，常依据其启动子区3个连锁位点的碱基突变（-52位G→A、-69位C→T、-567位T→G），分为GSTA1*A和*B等位基因，GSTA1*B等位基因因突变致启动子转录活性降低，致GSTA1酶蛋白表达水平下降，表现为GSTs对相应底物的解毒能力及其保护组织细胞抵御损伤的能力降低[3]，提示其可能与预处理过程常见的肝损伤并发症的发生有关。已有研究表明抗结核药所致肝损伤与该位点的多态性密切相关[4]。故本研究收集了115例以白消安为基础预处理的HSCT患者为对象，考察该人群中二者的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2014年3月至2018年5月收治于福建医科大学附属协和医院血液科，接受Ara-c/Flu/Bu/Cy、Ara-c/Bu/Cy、Flu/Bu等以白消安为基础的方案进行预处理的汉族HSCT患者115例；其中白消安的给药剂量基于患者调整后的理想体质量计算：0.8 mg/kg，q6h×4 d，微注泵推注2 h；所有患者预处理前肝肾功能均基本正常，并于预处理期间常规使用谷胱甘肽联合小分子肝素预防HVOD，使用环孢素和甲氨喋呤预防移植物抗宿主病的发生。该方案经医院伦理委员会审批同意；患者或家属知情并同意后方可执行。

1.2 仪器和试剂 Veriti DX Thermal Cycler PCR扩增仪（美国应用生物系统公司），OSE470蓝光切胶仪（天根生化科技公司），PS100电泳仪（上海天能公司），EasyPrue Blood Genomic DNA Kit、琼脂糖Agorose、染料Gelstain、6xDNA Loading Buffer、EasyTaq DNAPolymerrase、dNTPs、MgSO4、10x EasyTaq Buffer（北京全式金生物公司），FD EarⅠ、FD Buffer（赛默飞公司）。

1.3 DNA提取 采集患者静脉血2 mL，EDTA抗凝，严格按基因组提取试剂盒说明书操作。

1.4 GSTA1基因型测定 PCR反应体系参考课题组前期研究结果（20 μL）[5]：上游引物序列为5'-GCATCAGCTTGCCCTTCA-3'，下游序列为5'-AAACGCTGTCACCGTCCTG-3'，该引物对委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成并检测；设计总反应体系为20 μL，其中含4U DNA聚合酶、9 ng模板DNA、2.5 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L dNTPs、0.4 μmol/L上下游引物，余量用去离子水补足。扩增程序设为：先94 ℃预变性7 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共往复循环35次；最后一次循环结束后再72 ℃延伸7 min，后4 ℃保存；酶切反应体系（30 μL）：PCR纯化产物12 μL，FD EarⅠ 5U 1 μL，Buffer 2 μL，余量用去离子水补足，在37 ℃水浴锅中酶切30 min；琼脂糖凝胶电泳：胶染法制备2%琼脂糖凝胶，取5 μL酶消化产物和1 μL 6×Loading Buffer 混匀后上样，电泳条件均为电压5 V/cm，电泳时间20 min，用蓝光切胶仪观察；结果判定：只有1条401bp片段的判定为野生型，同时有401bp、308bp、93bp 3条片段的判定为杂合型，同时有308bp、93bp 2条片段的判定为纯突变型。

1.5 GSTA1基因型测定验证 随机抽取部分样本采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）对上述测定结果进行验证，上游引物序列为5'-ACGTTGGATGCTTAGAATCCAGT AGGTGGC-3'，下游引物序列为5'-GCTTTTCCCTAACTTGAC-3'，延伸引物序列为5'-ACGTTGGATGCCTCTCAATAGTTCTCTC CC-3'[6]，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体检测委托森广生物科技（北京）有限公司完成。图1为2条等位基因该位点碱基序列均为C即基因型为野生型的质谱峰图，图2为2条等位基因该位点碱基序列分别为C和T即基因型为杂合型的质谱峰图。

图1 GSTA1基因为野生型时的质谱峰图

图2 GSTA1基因为杂合突变型时的质谱峰图

1.6 急性肝损伤判定 参照《急性药物性肝损伤诊治建议（草案）》，观察患者在预处理及行造血干细胞移植住院期间，至少发生有一次以上ALT或DBIL值达正常值上限2倍以上或者AST、ALP、TBIL同时上升且至少1项达正常值上限2倍以上的，判断为急性肝损伤。

1.7 统计分析方法 采用SPSS 22.0软件对数据进行处理，计量资料以（±s）表示，计数资料以百分比表示，并采用χ2检验，基因多态性对急性肝损伤发生的影响以相对危险度（RR）、95%置信区间（CI）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 最终共有115例HSCT患者纳入本次研究：男性71例（61.7%），女性44例（38.3%）；年龄（28.20±15.61）岁；急性髓性白血病（AML）57例（49.6%），急性淋巴细胞白血病（ALL）31例（33.0%），慢性粒细胞白血病（CML）6例（5.2%），再生障碍性贫血（AA）7例（6.1%），骨髓增生异常综合征（MDS）5例（4.3%），多发性骨髓瘤（MM）2例（1.7%）；肝功正常93例（80.9%），出现急性肝损伤22例（19.1%）。

2.2 GSTA1基因分布情况及Hardy-Weinberg平衡检验 本研究人群的GSTA1基因分布情况见表1，Hardy-Weinberg平衡检验结果P＞0.05说明本研究人群具有群体代表性。

表1 GSTA1 C-69T（rs3957357）位点Hardy-Weinberg平衡检验[n（%）]

2.3 GSTA1 基因多态性与急性肝损伤的相关性 携带GSTA1*A/*B（杂合型）的患者急性肝损伤的发生率显著高于携带GSTA1*A/*A（野生型）的患者（P＜0.05）。见表2。

表2 GSTA1基因型与急性肝损伤发生的相关性

3 讨论

谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）是体内重要的Ⅱ相代谢酶，其功能主要是催化内源性或外源性亲电性有害物与谷胱甘肽结合，增加疏水性以便穿透细胞膜后排出体外或进入Ⅲ相反应，发挥解毒功效[7]；同时部分GSTs具有过氧化物酶和异构酶活性，可分解脂质过氧化物，在细胞中发挥抗氧化、抗损伤作用[8]。人类的GSTs主要以可溶性的二聚体的形式分布于各组织细胞液中，且主要在肝脏，由分布于多条染色体的一个超基因家族编码，少部分以膜结合蛋白的形式分布微粒体膜，由另一个超级因基因家族编码。依据亚基结构、氨基酸序列底物特异性、免疫原性等特点，胞液中的GSTs可分7大类：Alpha（α）、Mu（μ）、Pi（π）、Theta（Θ）、Sigma（σ）、Omega（ω）、Zeta（ξ），另有只存在于线粒体中的Kappa（K）类GSTs[9]。其中Alpha类（GSTA）在肝脏中含量最多（约75%）的GSTs，而GSTA1又在Alpha类中占比最高（约45%），可见GSTA1是肝脏内含量最高的GST同工酶，故其基因的表达水平可能显著影响肝脏GST酶的总体活性，进而影响肝脏整体二相代谢及抗损伤的能力。

目前研究已发现GSTA1基因启动子区域存在多个单核苷酸多态性（SNP）位点，可引起启动子活性的改变进而影响GSTA1基因的表达水平。其中-52、-69位点的突变可引起转录因子Sp1与启动子的选择性结合水平的降低下调GSTA1的表达，对GSTA1表达的影响最大，而连锁突变的-567位点的突变则引起转录因子GATA1与启动子结合水平的降低协同前二位点的下调表达作用[10]。因此基于这3个连锁位点的GSTA1基因的多态性（分为*A和*B等位基因）对Alpha类GSTs酶以至肝脏整体GSTs酶活性水平的影响最大。已有研究表明GSTA1*A/*B的GST酶活性显著低于GSTA1*A/*A，显著高于GSTA1*B/*B，而GSTM1缺失与否对GST酶活性无显著影响[11]。目前关于白消安的药物基因组学研究多数认为携带GSTA 1*B等位基因会导致白消安清除率显著下降[12]，提示GSTA1基因对白消安的代谢影响较大。

药物所致肝损伤的发生主要由药物和肝脏相应Ⅰ相、Ⅱ相、Ⅲ相代谢酶的种类、活性水平、肝细胞的脂质过氧化损伤水平、个体对药物及代谢物的免疫应激水平的匹配失衡所致，这些又与药物的剂量及个体的相关代谢酶或信号分子的基因多态性紧密相关[13]。白消安主要在肝脏经GSTs代谢，而预处理所使用白消安的剂量较大，短期在肝脏的蓄积量极有可能超出肝脏GSTs酶的Ⅱ相代谢能力和对脂质过氧化物的代谢能力，从而导致肝损伤。

本研究结果显示GSTA1*A/*B患者发生急性药物肝损伤的风险是GSTA1*A/*A患者的2.416倍（95%CI：1.160-5.032，P=0.022），考虑到上述GSTA1基因-52、-69、-567位点的多态性与GSTs的整体活性相关性，上述分析能较好的解释该结果。Ansari等[14]研究发现GSTs低代谢表型患者（主要为GSTA1*B等位基因携带者）肝窦阻塞综合征（SOS）的发生风险大为增加；Terakura等[15]研究发现GSTA1*B携带者给予第1剂白消安后的AUC（AUC1st）显著高于GSTA1*A/*A，而较高AUC1st水平的患者移植期间血清总胆红素水平显著较高；这些均提示携带GSTA1*B等位基因增加白消安为基础预处理方案所致肝毒性风险，可与本研究结果相佐证。而课题组前期研究未发现GSTT1、M1多态性与急性肝损伤相关性，这可能与GSTT1、M1多态性对总GSTs活性影响有限有关，也反映出GSTA1基因多态性对急性肝损伤的主要影响作用[16]。因此，有必要并对携带GSTA1*B等位基因的患者的肝功能加强监测和保护。

但GSTA1的活性水平除受GSTA1基因多态性影响外，还受多条信号通路的调控，有研究表明铅暴露可通过NF-κB信号通路下调GSTA1表达[17]，而JNK抑制剂则可通过JNK信号通路上调GSTA1的表达[18]；加之GSTs的种类繁多，对于同一底物，不同种类的GSTs之间可能存在代偿调节，可见GSTs总体活性影响因素的复杂性。而GSTs酶活性太低容易发生肝损伤及其他不良反应，而太高又可导致白消安清除过快影响疗效，故有必要对白消安实行个体化给药，而进一步的扩大样本量研究以确认定量关系将具有较大临床意义。