N-myc表达在儿童神经母细胞瘤完全缓解后复发中的作用*

李凡 张伟令 胡慧敏 张谊 陈莉萍 文圆 杜旭艳 黄东生

作者单位：首都医科大学附属北京同仁医院儿科（北京市100730）

神经母细胞瘤是儿童时期最常见的颅外实体瘤，占15 岁以下儿童所有肿瘤的7%，占所有因癌症死亡儿童的15%[1]。近年来，随着手术、化疗、放疗以及干细胞移植等综合治疗的开展，神经母细胞瘤患儿经治疗后的完全缓解率及5年生存率均显著提高。但仍有约50% 的高危患儿在治疗后出现复发[2]。神经母细胞瘤的复发通常伴随远处转移或新发病灶，患儿的病死率也随之显著增加[3-5]。

目前，多项研究表明[6-8]，MYCN 基因的扩增与N-myc 蛋白表达的增加是影响神经母细胞瘤患儿预后不良的重要因素。N-myc 蛋白是原癌基因MYCN编码的转录因子活化蛋白，其通过与同源的靶基因启动子相结合调节基因的转录，进而调节肿瘤细胞的增殖、代谢、凋亡及分化[9]。由于导致肿瘤复发的机制与一般预后不良的机制相同，但尚未明确N-myc 蛋白表达是否在神经母细胞瘤缓解后复发中发挥的作用。本研究通过对治疗后达到完全缓解的神经母细胞瘤患儿进行回顾性分析，探讨N-myc 蛋白表达与神经母细胞瘤完全缓解后复发的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

本研究为回顾性队列研究，选取2005年8月至2018年6月首都医科大学附属北京同仁医院收治的经手术病理证实为神经母细胞瘤且达到初次完全缓解标准的患儿121 例，其中49 例肿瘤组织标本经免疫组织化学法测定N-myc 蛋白表达，并被纳入本研究。其中男性28 例，女性21 例。根据国际神经母细胞瘤分期系统（INSS）[10]，分为2 期4 例，3 期18 例，4 期23 例，4S 期4 例。原发病灶部位：位于肾上腺或腹膜后39 例，纵隔8 例，盆腔2 例。根据国际神经母细胞瘤病理分类标准（INPC）[11]，分为神经母细胞瘤25 例，节细胞神经母细胞瘤（结节型）18 例，节细胞神经母细胞瘤（混杂型）6 例。本研究通过本院伦理委员会批准，并获得患儿家属知情同意。平均随访时间（58.35±3.10）个月，中位随访时间（59.00±4.92）个月。

1.2 方法

1.2.1 N-myc 蛋白表达检测方法及阳性的判定标准 采用免疫组织化学法对患儿的肿瘤病理组织标本进行N-myc 蛋白表达检测。病理组织切片经固定封闭处理，加入抗N-myc 鼠单克隆抗体（购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）及显色剂，经PBS 缓冲液冲洗，再加入HRP 标记抗人IgG 第二抗体（购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司），经PBS 缓冲液冲洗后苏木精复染，乙醇脱水干燥。检测结果判定标准：切片无染色细胞，结果判定为阴性；切片呈局灶状、散在状或弱染色，结果判定为弱阳性；切片呈弥漫性强染色或呈典型不均匀强化，结果判定为阳性。结果判定常规设置阳性对照及空白对照。

1.2.2 治疗方案 所有患儿均行手术、化疗和放疗。根据国际儿童肿瘤组（COG）原则并结合难治性神经母细胞瘤个体化治疗方案，低、中危组患儿的化疗方案包括卡铂+依托泊苷（CBVP）、环磷酰胺+吡柔比星+长春新碱（CTX+THP+VCR），高危组患儿的化疗方案包括环磷酰胺+吡柔比星+长春新碱（CDV）、顺铂+依托泊苷（CiE）、拓扑替康+环磷酰胺（TOPO+CTX）、顺铂+依托泊苷+吡柔比星+环磷酰胺（PECA）等。术前化疗2～6 个周期，术后化疗4～10 个周期，总化疗周期一般不超过16 个周期。肿瘤切除手术均在合作医院进行。低、中危组患儿的治疗方案以化疗联合瘤灶完全切除手术为主，高危组患儿则以化疗、放疗、瘤灶部分切除手术以及造血干细胞移植的综合治疗为主。辅助治疗包括使用阿米福汀降低化疗药物的不良反应、静脉营养支持、肠内营养支持治疗等。

1.2.3 肿瘤完全缓解及复发的判定标准 按照国际神经母细胞瘤反应分级（INRC）及肿瘤报告评估标准[12]。完全缓解是指所有原发和转移性病变完全消失，并至少维持4 周以上。肿瘤复发指患儿达到初次完全缓解后，在规律随访期间出现新发病灶。无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）是指从初次完全缓解到复发或最后1 次随访的时间。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。连续变量采用均值或中位数表示，分类变量采用频率和百分比表示。正态分布连续变量比较采用t检验，计数资料比较采用x2检验，单因素分析采用Kaplan-Meier 法，单因素间差异比较采用Log-rank 检验。采用多因素Cox 比例风险回归模型评估危险因素与肿瘤复发之间的关系。Cox 回归模型采用正向LR 法筛选独立危险因素。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较

根据N-myc 免疫组织化学结果将患儿分为两组，其中N-myc 蛋白表达阳性组27 例，N-myc 蛋白表达阴性组（对照组）22 例（图1）。本研究无N-myc 表达弱阳性病例。两组患儿的年龄比较[（2.675±2.118）岁vs.（3.148±2.265）岁]差异无统计学意义（x2=0.753，P=0.455）。两组患儿性别、INSS 分期比较，均差异无统计学意义（均P＞0.05）。两组患儿病理类型、原发病灶部位的比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。

图1 神经母细胞瘤组织N-myc 蛋白表达（ABC 法×200）

2.2 总生存率的比较

49 例完全缓解神经母细胞瘤患儿的1、3、5年总生存率分别为100.0%、85.6% 和75.7%。N-myc 蛋白表达阳性组患儿的1、3、5年总生存率分别为100.0%、77.4% 和64.2%，对照组分别为100.0%、95.5%和90.9%。本研究结果表明，N-myc 蛋白表达阳性组患儿的总生存率显著低于对照组（χ2=3.931，P=0.047，图2）。

图2 神经母细胞瘤完全缓解患儿的总生存曲线

2.3 RFS 率的比较

49 例神经母细胞瘤患儿完全缓解后的1、3、5年RFS 率分别为87.8%、67.3%和65.0%。N-myc 蛋白表达阳性组患儿的1、3、5年RFS 率分别为81.5%、55.6%和51.6%，对照组分别为95.5%、81.8%和81.8%。结果表明，N-myc 蛋白表达阳性组患儿的RFS 率显著低于对照组（x2=4.719，P=0.030，图3）。

图3 神经母细胞瘤完全缓解患儿的RFS 曲线

2.4 单因素及多因素分析

单因素分析结果显示，N-myc 蛋白阳性组与对照组在病理类型、原发病灶部位均差异具有统计学意义（均P＜0.05）。为进一步去除混杂因素对结果的影响，将年龄、性别、INSS 分期、病理类型、原发病灶部位、N-myc 蛋白全部纳入多因素Cox 比例风险回归模型进行变量筛选与剔除，以评估影响神经母细胞瘤完全缓解后复发的独立因素。结果提示，N-myc 蛋白表达阳性是影响神经母细胞瘤患儿完全缓解后复发的独立危险因素（95%CI：1.038～9.783，P=0.043），Nmyc 蛋白阳性的患儿在经过治疗达到完全缓解后的复发风险是N-myc 蛋白阴性患儿的3.187 倍。年龄、性别、INSS 分期、病理类型及原发病灶部位并非是影响神经母细胞瘤治疗后复发的独立因素（均P＞0.05）。

3 讨论

近年来，随着对神经母细胞瘤预后因素的深入研究，采用临床特征与分子生物学相结合的方法对神经母细胞瘤的临床预后进行评估已达成共识。目前，普遍认为年龄、INSS 分期、MYCN 基因扩增、组织病理类型等因素与神经母细胞瘤的预后密切相关。COG 根据年龄、INSS 分期、MYCN 状态、DNA 拷贝数（倍体）和组织学特征，将患儿分为低、中、高3个不同的风险类别，每级风险类别分别提示不同的无事件生存率及总生存率[13]。近年来，国际神经母细胞瘤风险分组（INRG）提出的分类标准采用了类似的方法用于评估神经母细胞瘤的预后[14]。虽然目前已经建立了神经母细胞瘤总体预后的分层评估方法，但关于如何预测神经母细胞瘤在经过治疗达到完全缓解后的复发概率以及如何有效防止肿瘤治疗后复发，尚无系统性的研究。

神经母细胞瘤患儿治疗后复发的概率远高于其他恶性实体肿瘤，高危组患儿总体复发率高达50%。近年来，随着手术、化疗、放疗和造血干细胞移植等综合治疗的开展以及化疗方案的改进，神经母细胞瘤患儿经过治疗后的缓解率已显著提升。尽管如此，患儿在完全缓解后的复发概率仍较高。一旦出现缓解后复发，需要进行挽救性治疗。目前，挽救性治疗方案尚无统一共识，治疗方法主要包括化疗、骨髓造血干细胞移植、间碘苄胍（metaiodobenzylguanidine，MIBG）治疗、抗体或细胞介导的免疫治疗等。挽救性治疗在低危、中危组且局部复发的病例中疗效较好[15]。对于高危组患者，尤其是伴随多灶性转移的病例，治疗效果较差，复发后中位生存期仅11 个月[16]，5年总生存率仅20%[17]。由于导致神经母细胞瘤缓解后复发的机制可能有别于一般预后不良的机制，因此复发因素也应区别于一般的预后因素研究而单独进行分析。

本研究通过对49 例经综合治疗达到完全缓解标准的神经母细胞瘤患儿进行回顾性分析，发现N-myc蛋白表达阳性患儿的总生存率及RFS 率均显著低于N-myc 蛋白表达阴性的患儿，且N-myc 蛋白表达阳性的患儿在完全缓解后复发的风险是N-myc 蛋白阴性患儿的3.187 倍。与此同时，通过多因素回归分析模型对变量进行筛选后发现，年龄、性别、INSS 分期、病理类型及原发病灶部位等并非是影响神经母细胞瘤治疗后复发的独立因素（均P＞0.05）。虽然本研究发现N-myc 蛋白表达是导致神经母细胞瘤患儿治疗后复发的关键因素，但由于缺少MYCN 基因扩增资料，尚无法准确推断MYCN 基因扩增、转录水平与神经母细胞瘤复发之间是否存在必然联系。虽有研究表明[18]，MYCN 基因扩增与N-myc 蛋白的表达有良好的相关性，但仍需进一步研究以明确MYCN 基因扩增在神经母细胞瘤缓解后复发中的作用。后续研究需扩充样本量，并通过建立动物实验模型，探索N-myc在肿瘤复发中的作用机制，以进一步明确MYCN 基因扩增与表达在神经母细胞瘤缓解后复发中的作用。

综上所述，N-myc 蛋白表达是影响神经母细胞瘤患儿完全缓解后复发的关键因素之一。由于N-myc蛋白表达在肿瘤缓解后的复发机制中发挥重要作用，即使N-myc 蛋白表达阳性的初治患儿在经过综合治疗后可以获得完全缓解，其复发风险及病死率依然显著高于N-myc 蛋白表达阴性的患儿。因此，对于Nmyc 蛋白表达阳性的神经母细胞瘤患儿，临床医师需要更加重视对初始治疗方案的调整、完全缓解后的巩固治疗以及加强肿瘤复发的监测，从而最大限度避免神经母细胞瘤治疗后复发，以改善患儿长期预后。