基于时域分光法的微小容量测量方法研究

刘鑫行, 张殿龙, 张竟月, 孙 斌, 佟 林 赵玉晓, 钟家栋

(1. 中国计量大学, 浙江 杭州 310018; 2.中国计量科学研究院， 北京 100029)

1 引 言

微小容量的应用广泛,主要应用于生物制药、医学检验、化学测试等领域[1,2]。医疗分析仪的单次试剂常用移液量为100 μL[3],生化测试中聚合酶链式反应通常需要配制50 μL溶液[4,5],各领域需要转移的液体容量已从毫升向微升级扩展[3,5]。微量液体的容量转移要求较高,移液器、进样器等由于体积小、便于携带成为主要计量器具[6]。在长期使用时,移液器由于弹簧形变等原因,容量失准率会增高[7],所以需要对移液器进行定期校准。目前用于液体容积检测方法主要分为2类：重力法和非重力法。

重力法采用高精度的电子天平,是目前使用最多的方法。我国现今用于计量检定的方法也是基于重力法,该方法对实验环境要求高,很难实现在线测量,且高精度的电子天平价格昂贵。非重力法主要有光学法和滴定法等[8],滴定法是基于化学反应,如沉淀等计算加入液体的体积[9]。光学法可分为单波长测量和双波长测量,对环境要求不高,可实现在线测量。

本文基于时域分光的模式,结合双波长测量,提出了一种非重力法的微小容量检测方法。该方法满足ISO-8655的技术要求的同时,可以通过调整原液浓度和稀释比例大大提高实验效率,与传统重力法进行比较得到了一致的结论,验证了方法的可行性。

2 微小溶液容积测量的基本原理

为克服静力衡量法环境要求高等问题,非重力法是目前研究的趋势。光学法是基于溶液吸光度与溶液浓度的关系,即当一束单色平行光通过某溶液时,该溶液的吸光度A与入射光强I和透射光强I0的比值有关,见式(1)。

(1)

也可以表示为式(2),在一定条件下,吸光度与溶液的浓度c和通过溶液的光程b成正比,摩尔吸光系数K为常数。

A=Kbc

(2)

由式(2)可知,当摩尔吸光系数K和光程b一定时,吸光度仅与溶液的浓度有关。但在实际操作过程中,在使用分光光度法进行实验时,不同的比色皿之间测得的吸光度并不一致,用单波长来测量溶液的体积很难避免加工带来的光程误差,所以用分光光度法进行容积检测时可选择双波长测量方法[10]。

2.1 双波长测量原理

双波长测量时所用的2种液体要求被测原液在波长1处有吸收峰,稀释液在波长2处有吸收峰且在波长1处没有吸光度或吸光度接近0。被测原液体积的测量过程分为3步。

1) 标准液的吸光度测试：分别测试标准液在波长520和730 nm处的吸光度AS1及AS2,标准液的吸光度也可由式(3)获得：

(3)

式中：R为标准液的稀释比例,VS1和VS2分别为标准液中原液和稀释液的体积；K1和K2分别为标准液中原液和吸释液的摩尔吸光系数；b1，b2为光透过溶液的光程；c1，c2分别为原液和稀释液的浓度。

2) 稀释液的吸光度测试：在同样2个波长处对已知体积VD的稀释液进行吸光度测试,得到吸光度AD1和AD2,对2个吸光度做差去除背景噪声建立零点,表达式见式(4)：

AD2-AD1=K2b2c2

(4)

3) 混合液吸光度测试：用移液器将体积为VU的原液加至步骤2)中的稀释液,混合均匀后测量波长520 nm处的吸光度AU,同理去除背景噪声后的表达式由式(5)表示:

(5)

联立式(3)、式(4)和式(5),可得被测原液的体积VU如式(6)所示。

(6)

通过上述比值计算可以将比色皿的加工带来的误差大大减小。

JJG 646—2006《移液器检定规程》中要求对微小容量校准时需要校准3个测量点,每个测量点需要测量6次,若用光学法进行实验,校准1支移液器就需要18个比色皿。

由于比色皿是一种较高精度的光学元件,校准时使用的比色皿需经常更换。为此,本实验对溶液浓度进行调整,保证溶液的吸光度在线性范围内尽可能多次试验,提高比色皿的使用率。

以50 μL原液为例。由于实验中稀释液的体积VD已知,每次加入的原液体积一定,则混合液中两者的比例确定,由式(7)可知溶液的吸光度比值等于稀释比例的比值,式(7)中A1、A2和R1、R2分别为稀释前后溶液的吸光度和稀释比例，K为溶液的摩尔吸光系数，c为溶液的浓度，l为比色皿的宽度。若要保证溶液的吸光度多次在0.2～0.8内,按稀释比例间的比值可以获得第i次的理论吸光度Ai,经过计算每个比色皿最多可用3次,每次加入的原液体积由式(9)计算,其中AUi+1为第i+1次加入原液后的吸光度,Vi+1为第i+1次加入原液后的总体积,Vi为第i次的总体积。如令第一次加入原液后的吸光度A1为0.25,则A3的理论值就为0.72,A1已知可以由式(8)确定溶液的浓度。

(7)

(8)

(9)

2.2 时域分光原理

双波长测量时需要系统进行分光处理获得2种波长,系统的分光原理主要有时域分光和空域分光2种形式。与空域分光不同,时域分光是在时间域上分光,即复色光源在通过吸收池前先由分光系统进行前分光得到单色光,然后将单色光入射到被测样品，根据溶液在该单色光下的吸光度可以计算出溶液体积,可以计算出溶液的体积。空域分光也可称为后分光,即光源在进入样品室后再由分光系统分光,该方法可以在同一时刻得到各个波长的单色光,实现空间上的波长分离。与空域分光系统相比,时域分光系统对光源的稳定性要求较高,但光路和信号处理方式较为简单,探测器一般选用光电二极管、光电倍增管等[10～12]。

分光元件是分光系统中主要的元件,常用的有棱镜和光栅2种[13]。棱镜分光原理是因为不同波长的光在同一介质中折射率不同,可将复色光源分成不同波段的光谱[14]；光栅是由大量等宽等间距的平行狭缝组成的光学元件,每个狭缝都可以发生多缝衍射形成色散。

衡量分光元件的色散本领通常以角色散率和线色散率表示。从棱镜和光栅的色散公式可知,棱镜对短波长的色散能力更强,但棱镜色散的非线性会大大增加光谱定标的难度。

反射光栅的色散能力与光栅常数、光谱级次和入射角有关,由于光栅常数普遍较小,光栅的色散能力较强。从波长分辨率分析,棱镜的波长分辨率与材料色散率和自身尺寸有关,在光谱分析时可以选用底边宽度较宽的棱镜来提高波长分辨率[14,15]；光栅光谱的波长分辨率可由式(10)表示：

(10)

式中:λ为波长;Δλ光谱宽度。

增加光栅的狭缝数N可以提高光栅分辨率。棱镜和光栅虽均可用于光谱分析,但光栅刻痕可以很多(即N可以很大),所以与棱镜相比光栅光谱更精细,波长分辨率也更高[15，16]。

实验通过双波长测量减小了由比色皿的加工误差带来的影响,调整原液浓度实现多次测量,提高耗材利用率,并选用光栅作为分光元件设计了一套基于时域分光法的微小容量检测系统。

3 实验与数据分析

本实验采用时域分光的原理进行微小容量检测,其测量原理如图1所示。

图1所示系统的分光方式属于前分光,光源从入射狭缝S1进入分光系统,经凹面镜M2反射至光栅G,由光栅分光处理后从反射镜M3和M4反射至出射狭缝S2,然后将单色光入射到样品室中测量溶液吸光度,分光系统的操作波长范围在300～800 nm,波长重复性和准确性为0.2%,所需波长可由电机控制。实验采用的光源是20 W额定功率钨灯,图2是钨灯光源在520 nm处稳定性实验数据,每隔10 min测量一次电压,数据显示光源的稳定性小于0.15%,能够满足实验要求。探测器采用的是光电二极管,该探测器具有灵敏度高、噪声小的特点,能够探测微弱信号。

图1 测量原理图Fig.1 Basic structure of the system

图2 光源稳定性实验Fig.2 Experiment of light source stability

将1支已校准的100 μL定点移液器按照上述测量过程进行实验,实验数据如图3所示,根据数据计算所得的容量允许误差E和重复性S如表1所示,结果显示通过时域分光原理所得的溶液容量的允许误差和重复性均在规程规定的范围内,检定的结果与传统重力法一致。

图3 100 μL测量点光学法和重力法对比实验Fig.3 Comparative experiment of optical method and gravity method at 100 μL measuring point

表1 光学法和重力法在100 μL测量点的 相对误差和重复性Tab.1 Relative error and repeatability of optical method and gravity method at 100 μL measuring point (%)

同理配制50 μL测量点多次实验的原液浓度,取已检定的移液器在比色皿中重复做3次试验,实验数据如图4所示,根据数据计算所得的容量允许误差E和重复性S如表2所示,数据显示通过调整原液浓度可实现比色皿的重复使用,且容量的偏差和重复性均在规程的允差范围内。

图4 50 μL测量点光学法和重力法对比实验Fig.4 Comparative experiment of optical method and gravity method at 50 μL measuring point

表2 光学法和重力法在50 μL测量点的 相对误差和重复性Tab.2 Relative error and repeatability of optical method and gravity method at 50 μL measuring point (%)

4 结 论

通过实验数据可得出以下结论：

1) 使用时域分光法对微小溶液进行测量，能够计算出待测溶液的体积,在100 μL测量时光学法测得的容积为99.67 μL,重复性为0.35%,所得容量的允许误差和重复性满足要求,为微小溶液容量计量提供了一种新的方法；

2) 本实验对溶液的浓度进行调整,验证了在吸光度的线性范围内比色皿能够重复使用得到溶液的体积,在50 μL测量实验中测得容积为50.11 μL,重复性为1.22%。与传统重力方法的检定结果一致；本实验对每一个测量点均可以进行溶液浓度调整,在保证吸光度线性范围内可实现多次测量；

3) 基于时域分光原理所得溶液体积的方法与传统的重力法相比,对实验的环境要求不高,可实现在线测量。