紫草素调节结核分枝杆菌诱导THP-1细胞炎症反应的机制研究

李秀萍，王 玲，王 馨，祁兴春，董 力

紫草素是从紫草根中提取的主要生物活性成分。有研究表明，紫草素具有治疗癌症、炎症和伤口愈合相关的多种功能[1]，但紫草素的药理作用机制有待探究。Rho激酶(Rho kinsase， ROCK)包括ROCKⅠ和ROCKⅡ两种类型[2-3]。ROCKⅠ参与癌症、炎症损伤等多种疾病的致病过程[4]，该基因是否受紫草素的调控尚不清楚。本研究通过构建结核分枝杆菌诱导THP-1细胞炎性损伤模型，观察紫草素对细胞炎性因子分泌的影响，并分析其与ROCKⅠ/NF-κB信号通路之间的关系，为紫草素的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 紫草素由中国食品药品检定研究院提供；结核分枝杆菌由中国疫病控制中心结核病实验室提供； THP-1购自中国上海科学研究院细胞库；细胞计数试剂盒(CCK-8)购自北京康为世纪；荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒购自北京索莱宝公司；兔抗ROCKⅠ抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗购自上海艾博抗公司。

1.2方法

1.2.1THP-1细胞的培养：培养液为15%胎牛血清的RPMI 1640培养基，混有1%双抗(青链霉素)；培养条件：37 ℃，5% CO2，饱和湿度的恒温细胞培养箱；隔天传代1次。

1.2.2细胞处理与分组：将培养48 h的THP-1细胞标记为空白组；将空白组细胞用结核分枝杆菌(病毒载量10)处理24 h作为模型组；将紫草素用DMSO稀释成0.50、2.50、12.50、62.50 μg/ml，取等剂量药物与模型组细胞混合培养48 h，分别标记为0.50、2.50、12.50、62.50 μg/ml组，筛选最适浓度标记为实验组；用等剂量的DMSO与模型组细胞混合培养48 h标记为对照组；si-NC、si-ROCKⅠ、pcDNA、pcDNA-ROCKⅠ分别转染模型组细胞，标记为si-NC组、si-ROCKⅠ组、pcDNA组、pcDNA-ROCKⅠ组；将pcDNA、pcDNA-ROCKⅠ转染实验组细胞，标记为实验+pcDNA组、实验+pcDNA-ROCKⅠ组。

1.2.3CCK-8实验：取待检测的空白组、模型组、对照组、紫草素组(0.50、2.50、12.50、62.50 μg/ml)，用培养液调至每毫升1×105个细胞。取100 μl加入酶标板，再加入CCK-8溶液，混匀，避光孵育15 min，置于酶标仪读数。细胞抑制率(%)=(1-A490各个处理组/A490 空白组)×100%。

1.2.4RT-qPCR实验：将各组待检测的细胞用Trizol液提取总RNA，用核酸检测仪检测RNA的完整性和质量。快速将提取的RNA逆转录为cDNA，再用RT-qPCR试剂盒检测各个cDNA中ROCKⅠ、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、巨噬细胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)的mRNA表达水平。条件为：94 ℃，30 min；58 ℃， 30 s；72 ℃， 30 s 进行循环扩增, 后延伸温度72 ℃，12 min。共41个循环。

1.2.5蛋白免疫印迹实验：将需要检测的细胞用裂解液冰上裂解，提取总蛋白，BCA法蛋白定量，煮沸变性，然后用于上样。行SDS-PAGE蛋白电泳，蛋白转膜、封闭。兔抗ROCKⅠ抗体稀释1000倍，用于孵育封闭后的膜(4 ℃，12 h)。轻轻取出膜，用1500倍稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗37 ℃孵育2 h。显影、曝光，以目的蛋白的表达量与内参GAPDH的比值表示蛋白的表达量。

2 结果

2.1紫草素调控结核分枝杆菌诱导THP-1细胞炎性因子的表达 与空白组比较，模型组细胞抑制率和TNF-α、IL-1β、MIP-3α mRNA表达均上调(P<0.01)。与模型组比较，紫草素0.50、2.50、12.50、62.50 μg/ml组细胞抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)；但炎性因子TNF-α、IL-1β、MIP-3α mRNA表达量随紫草素浓度的升高而明显降低(P<0.01)。故选用对炎性因子变化最显著的浓度(2.50 μg/ml)用于后续实验。见表1。

表1 紫草素对结核分枝杆菌诱导THP-1细胞的抑制率和炎性因子表达的影响

2.2紫草素调节结核分枝杆菌诱导THP-1细胞中ROCKⅠ的表达 与对照组比较，实验组结核分枝杆菌诱导THP-1细胞中ROCKⅠ的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。见图1和表2。

表2 紫草素对结核分枝杆菌诱导THP-1细胞中ROCKⅠmRNA和蛋白表达情况比较

图1 紫草素对结核分枝杆菌诱导的THP-1细胞中ROCKⅠ表达蛋白免疫印迹图实验组为用紫草素2.50 μg/ml处理的THP-1细胞，对照组为DMSO与模型组细胞混合培养48 h,模型组为结核分枝杆菌处理的THP-1细胞；ROCKⅠ为Rho激酶Ⅰ

2.3敲减ROCKⅠ调节结核分枝杆菌诱导THP-1细胞炎性因子表达 与si-NC组比较，si-ROCKⅠ组结核分枝杆菌诱导THP-1细胞中ROCKⅠ、TNF-α、IL-1β、MIP-3α mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 敲减ROCKⅠ调节结核分枝杆菌诱导THP-1细胞炎性因子表达水平比较

2.4过表达ROCKⅠ对紫草素调节结核分枝杆菌诱导THP-1细胞炎性因子分泌的调控 与实验+pcDNA组比较，实验+pcDNA-ROCKⅠ组结核分枝杆菌诱导THP-1细胞中ROCKⅠ、TNF-α、IL-1β、MIP-3α mRNA表达水平升高(P<0.01)。见表4。

表4 过表达ROCKⅠ对结核分枝杆菌诱导THP-1细胞炎性因子分泌的调控

2.5NF-κB信号通路调节在紫草素抗炎功能中与ROCKⅠ的关系 与对照组、si-NC组比较，实验组、si-ROCKⅠ组结核分枝杆菌诱导THP-1细胞中P65、IκBα、ROCKⅠmRNA和ROCKⅠ蛋白表达均显著降低(P<0.01)。与实验+pcDNA组比较，实验+pcDNA-ROCKⅠ组结核分枝杆菌诱导THP-1细胞P65、IκBα、ROCKⅠmRNA和ROCKⅠ蛋白表达均显著升高(P<0.01)。见图2和表5。

表5 NF-κB信号通路与ROCKⅠ在不同处理方式结核分枝杆菌诱导THP-1细胞中的表达情况

图2 ROCKⅠ蛋白在不同处理方式的THP-1细胞中的表达蛋白免疫印迹图A.对照组；B.实验组；C.si-NC组；D.si-ROCKⅠ组；E.实验+pcDNA组；F.实验+pcDNA-ROCKⅠ组；ROCKⅠ为Rho激酶Ⅰ；对照组为DMSO与模型组细胞混合培养48 h，模型组为结核分枝杆菌处理的THP-1细胞

3 讨论

大量研究报道，紫草素有益于人类多种疾病的治疗，如心肌损伤、脑损伤、神经损伤及癌症等[5-6]，但是紫草素治疗作用的机制尚未十分清楚。Guo等[7]研究报道，紫草素能够在体内外抑制乙酰氨基酚对肝脏的毒性作用，表现为下调氧化应激相关基因表达，包括蛋氨酸亚砜还原酶、血红素加氧酶-1、超氧化物酶2和细胞色素，紫草素还可显著抑制乙酰氨基酚诱导的TNF-α、IL-6和IL-1β的产生，并抑制炎症相关基因的表达。Yang等[8]发现，紫草素可缓解心脏损伤模型小鼠的心力衰竭，其中包括抑制炎症反应、减少心肌纤维化、减少细胞凋亡和内质网应激。近期有报道称，紫草素对紫癜性肾炎大鼠血清中炎性因子的分泌具有抑制作用，并可减轻大鼠肾脏损伤程度，这与紫草素提高肾组织中裂孔隔膜蛋白的表达有关[9]。本实验结果显示，紫草素呈浓度依赖性降低结核分枝杆菌诱导的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β、MIP-3α的分泌。进一步研究发现，紫草素还可下调ROCKⅠ表达，猜测这可能与紫草素的抗炎功能具有一定联系。

ROCKⅠ促进炎性细胞因子和趋化因子的产生，在多种疾病中发挥促炎作用[10]。Alokam等[11]研究报道，抑制ROCKⅠ后，甲基汞诱导的神经母细胞瘤细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平均下降，说明ROCKⅠ抑制剂有望治疗神经障碍疾病。Galvão等[12]报道，ROCKⅠ抑制剂能够抑制痛风小鼠模型中中性粒细胞的积累，揭示了抑制ROCKⅠ具有成为治疗中性粒细胞炎症疾病的潜在靶点。但是，ROCKⅠ参与炎症反应的机制尚未十分清楚。本研究结果显示，敲减ROCKⅠ明显抑制了结核分枝杆菌诱导的THP-1细胞的炎性因子分泌，且过表达ROCKⅠ能够逆转紫草素对THP-1细胞的抗炎功能。深入研究发现，NF-κB信号通路关键基因P65、IκBα 的表达能够被紫草素、敲减ROCKⅠ下调，并且过表达ROCKⅠ还可减弱紫草素下调P65、IκBα 的作用。这些实验结果说明，敲减ROCKⅠ具有与紫草素相类似的抑制炎性因子分泌和NF-κB信号通路活性的功能，揭示紫草素对THP-1细胞抗炎作用与抑制ROCKⅠ/NF-κB信号通路的活性有关。

综上所述，紫草素具有抑制结核分枝杆菌诱导THP-1细胞炎症反应的作用，其机制与ROCKⅠ/NF-κB信号通路的活性紧密相关，为紫草素用于临床炎症疾病治疗提供支持。可见，过表达ROCKⅠ可逆转紫草素对结核分枝杆菌诱导THP-1细胞致炎因子分泌的抑制作用。