褪黑素调控SIRT1/FOXO1通路延缓椎间盘髓核细胞退变的实验研究

左 斌，夏晓枫，车 彪，何精选，唐家国

腰椎间盘突出是由多种因素产生的复杂脊柱疾病[1]，主要原因为椎间盘退变。腰椎间盘组织再生能力有限，而髓核细胞(NPCs)是腰椎间盘组织的唯一构成细胞，NPCs退变可直接使椎间盘组织中细胞数量减少[2]。椎间盘退变的机制涉及NPCs凋亡和炎症反应的产生，褪黑素不仅能促进NPCs的增殖[3]，还能抵抗氧化应激诱导的NPCs凋亡[4]。沉默信息调节因子(SIRT)可以降低氧化应激水平和炎症程度[5]，还可通过叉头框转录因子O1(FOXO1)途径调节氧化应激诱导的大鼠NPCs衰退[6]。但是褪黑素调控SIRT1/FOXO1通路对椎间盘NPCs退变的影响，目前报道较少。本研究通过使用过氧化氢处理椎间盘NPCs以诱导氧化性损伤，模拟体外NPCs退变，并干扰SIRT1后使用褪黑素处理，旨在从SIRT1/FOXO1通路探讨褪黑素对椎间盘NPCs退变的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1人椎间盘髓核组织：本研究所用髓核组织源于长江航运总医院骨外科腰椎间盘突出症患者12例，年龄45～67岁，平均52岁，保守治疗无效。所有患者均已自愿签订知情同意书，本研究获得医院伦理委员会审批，伦理批准编号：L20200058。

1.1.2主要试剂和仪器：褪黑素(原料药，纯度99%，西安金绿生物工程技术有限公司,批号：73-35-2)；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)购自北京智杰方远科技有限公司,批号：VN10053；siRNA NC(RNA干扰阴性对照)和siRNA SIRT1(RNA干扰SIRT1表达载体)均由上海生工生物科技有限公司合成(批号：K10059、K10061)；RNA抽提试剂盒(批号：P1063)、逆转录试剂盒(批号：PD5017)、荧光定量PCR试剂盒(批号：SF4113L)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(批号：C1065S)均购自上海碧云天生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α，批号：m1034517)、白细胞介素-1β(IL-1β，批号：m1062451)、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；聚集蛋白聚糖(Aggrecan，批号：ab60133)、Ⅱ型胶原蛋白(collagen Ⅱ，批号：ab60472)、SIRT1(批号：ab60355)、FOXO1乙酰化(acely-FOXO1，批号：ab60857)购自美国Abcam公司；FLUOstar Omega型全自动多功能酶标仪购自德国BMG LABTECH公司；TL988型qRT-PCR仪购自西安天隆科技有限公司；Attune NxT型流式细胞仪购自北京昊诺斯科技有限公司。

1.2方法

1.2.1NPCs的分离与培养：将12例髓核组织用无菌眼科剪剪成约1 mm3的块状后混合，加入适量0.25%胰蛋白酶消化30 min后。置于0.2% Ⅱ型胶原酶中室温消化4 h。使用200目滤网过滤并离心收集细胞，然后加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞，放入37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。当细胞贴壁生长后，使用倒置显微镜观察并鉴定细胞。当细胞密度为80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶消化传代并进行后续实验。

1.2.2CCK-8法检测NPCs的细胞活性：收集NPCs，调整细胞浓度为每毫升1×105个，每孔接种100 μl至96孔板中，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h使细胞贴壁，空白孔加入100 μl培养液，其余各孔依次加入终浓度为0、100、200、300、400 μmol/L过氧化氢或终浓度为0、0.01、0.1、1 μmol/L褪黑素的培养液，继续培养24 h，加入浓度为10%的CCK-8溶液，培养2 h后，于酶标仪上检测各孔在450 nm波长下的OD值。每组各设6个复孔。细胞增殖率(%)=(实验孔OD450 nm-空白孔OD450 nm)/(对照孔OD450 nm-空白孔OD450 nm)×100%。

1.2.3细胞转染与分组：调整NPCs浓度为每毫升1×106个，接种于6孔板，使用Lipfectamine 3000转染试剂盒分别将siRNA NC和siRNA SIRT1转染细胞24 h后，使用200 μmol/L过氧化氢处理以诱导氧化性损伤，细胞分为过氧化氢组(仅使用200 μmol/L过氧化氢处理)、褪黑素+过氧化氢组(200 μmol/L过氧化氢、1 μmol/L褪黑素处理)、褪黑素+siRNA NC组(细胞转染siRNA NC后使用200 μmol/L过氧化氢、1 μmol/L褪黑素处理)、褪黑素+siRNA SIRT1组(细胞转染siRNA SIRT1后使用200 μmol/L过氧化氢、1 μmol/L褪黑素处理)，另取不使用过氧化氢处理的非转染NPCs作为对照组。各组细胞处理24 h后，检测各项指标。

1.2.4SIRT1 mRNA表达水平检测：RNA抽提试剂盒提取各组细胞总RNA，逆转录试剂盒得到cDNA，以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系：2×SYBR mix 10 μl，水8 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl。反应条件设定为：95 ℃预变性5 min、95 ℃变性15 s、60 ℃退火50 s、72 ℃延伸10 min，40个循环。以GAPDH为内参，根据2-ΔΔCt计算SIRT1 mRNA表达水平。SIRT1、GAPDH引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡率：收集各组细胞，1200 r/min，离心5 min，弃上清，用PBS洗涤2次后，加入400 μl结合缓冲液悬浮细胞，再加入5 μl Annexin V染液，轻轻混匀后置于2～8 ℃避光条件下孵育15 min；然后加入10 μl PI轻轻混匀，于2～8 ℃避光下继续孵育5 min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复6次。

1.2.6ELISA检测TNF-α、IL-1β含量：收集各组细胞上清液，严格按照试剂盒说明书进行检测，每组设置6个重复。

1.2.7蛋白免疫印迹法检测退化相关指标Aggrecan、collagen Ⅱ以及SIRT1、FOXO1蛋白表达水平：收集各组细胞，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，应用BCA蛋白定量试剂盒进行定量检测。然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转PVDF膜、5%脱脂奶粉封闭1 h、1∶1000浓度稀释后的Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1、FOXO1、acely-FOXO1和GAPDH一抗4 ℃过夜孵育、含辣根过氧化物酶缀合的二抗室温孵育2 h。用ECL显色试剂盒显色，凝胶成像分析系统拍照。以GAPDH为内参，分析各组蛋白表达水平，每组设置6个重复。

2 结果

2.1原代退变椎间盘NPCs形态 人原代退变椎间盘NPCs多呈类圆形、多角形或梭形。见图1。

图1 人原代退变椎间盘NPCs形态(×40)NPCs为髓核细胞

2.2褪黑素对过氧化氢处理NPCs增殖率的影响 200、300、400 μmol/L过氧化氢均可显著抑制NPCs增殖(P<0.05)。后续将使用200 μmol/L过氧化氢处理以诱导氧化性损伤。使用0、0.01、0.1、1 μmol/L褪黑素处理损伤NPCs后发现，1 μmol/L褪黑素能显著提高200 μmol/L过氧化氢处理的NPCs增殖率(P<0.05)。见图2。

图2 不同浓度褪黑素对过氧化氢处理的NPCs增殖率的影响NPCs为髓核细胞；与过氧化氢0 μmol/L时比较，aP<0.05；与过氧化氢浓度为200 μmol/L、褪黑素0 μmol/L时比较，bP<0.05

2.3褪黑素对过氧化氢处理NPCs中SIRT1 mRNA表达水平的影响 5组STRTI mRNA表达水平分别为：对照组1.00±0.00、过氧化氢组0.52±0.06、褪黑素组0.83±0.09、褪黑素+siRNA NC组0.87±0.10、褪黑素+siRNA SIRT1组0.46±0.05。与对照组比较，过氧化氢组NPCs中SIRT1 mRNA表达水平降低(P<0.05)；与过氧化氢组比较，褪黑素组和褪黑素+siRNA NC组NPCs中SIRT1 mRNA表达水平升高(P<0.05)；与褪黑素组和褪黑素+siRNA NC组相比，褪黑素+siRNA SIRT1组NPCs中SIRT1 mRNA表达水平降低(P<0.05)。

2.4褪黑素对过氧化氢处理NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量的影响 与对照组比较，过氧化氢组NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量升高(P<0.05)；与过氧化氢组比较，褪黑素组和褪黑素+siRNA NC组NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量降低(P<0.05)；与褪黑素组和褪黑素+siRNA NC组比较，褪黑素+siRNA SIRT1组NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量升高(P<0.05)。见表1。

表1 5组NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量比较

2.5褪黑素对过氧化氢处理的NPCs细胞凋亡的影响 5组细胞凋亡率分别为：对照组(3.87±0.39)%、过氧化氢组(34.35±3.52)%、褪黑素组(12.26±1.35)%、褪黑素+siRNA NC组(13.55±1.48)%、褪黑素+siRNA SIRT1组(25.64±3.63)%。与对照组比较，过氧化氢组NPCs凋亡率升高(P<0.05)；与过氧化氢组比较，褪黑素组和褪黑素+siRNA NC组NPCs凋亡率降低(P<0.05)；与褪黑素组和褪黑素+siRNA NC组比较，褪黑素+siRNA SIRT1组NPCs凋亡率升高(P<0.05)。

2.6褪黑素对过氧化氢处理的NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1和FOXO1蛋白表达的影响 与对照组比较，过氧化氢组NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1蛋白表达水平降低，acely-FOXO1蛋白水平升高(P<0.05)。与过氧化氢组相比，褪黑素组和褪黑素+siRNA NC组NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1蛋白表达水平升高，acely-FOXO1蛋白水平降低(P<0.05)。与褪黑素组和褪黑素+siRNA NC组相比，褪黑素+siRNA SIRT1组NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1蛋白表达水平降低，acely-FOXO1蛋白水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 5组NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1、acely-FOXO1蛋白表达水平比较

3 讨论

有研究报道，遗传和环境因素均可引起椎间盘退变[7]，而NPCs是构成椎间盘组织的唯一细胞，其功能的衰退是引起椎间盘退变的主要原因[8]。另外，过氧化氢可在体外处理NPCs以诱导氧化性损伤模拟椎间盘功能衰退[9]。本研究结果显示，过氧化氢能显著抑制NPCs增殖，且1 μmol/L褪黑素能显著提高NPCs增殖率。因此后续分别使用200 μmol/L过氧化氢和1 μmol/L褪黑素处理椎间盘NPCs。

椎间盘退变发病机制包括细胞氧化应激、线粒体功能障碍和细胞凋亡，褪黑素可以消除氧自由基，调节线粒体的平衡和功能，防止细胞凋亡[10]。Guo等[11]研究发现褪黑素能有效预防骨关节炎。另外，Zhang等[12]研究发现褪黑素可减轻大鼠椎间盘退变和炎症。褪黑素治疗可改善人软骨细胞的增殖，促进软骨细胞外基质蛋白(Aggrecan和collagen Ⅱ)的表达[13]。另外，在退变椎间盘中SIRT1表达降低，SIRT1的激活可以抑制NPCs的凋亡，促进细胞增殖[14]。在椎间盘退变过程中Aggrecan和collagen Ⅱ蛋白表达水平显著降低，导致椎间盘形态及结构改变[15]。本研究结果显示，褪黑素能显著提高NPCs中SIRT1 mRNA及蛋白、Aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表达水平，并使TNF-α和IL-1β含量、细胞凋亡率及acely-FOXO1蛋白水平显著降低。Ge等[16]研究发现，褪黑素能够改善细胞存活和功能，从而保护椎间盘不发生退变。另外，褪黑素可抵抗脂多糖处理的大鼠海马组织氧化应激损伤、急性神经炎症和凋亡性神经退行性变[17]。以上研究表明，褪黑素可调节细胞外基质蛋白表达水平，降低炎症反应和细胞凋亡，缓解椎间盘NPCs退变。本研究结果同时显示，与褪黑素组和褪黑素+siRNA NC组相比，干扰SIRT1显著提高细胞凋亡率，与Shen等[18]研究结果一致。另外，干扰SIRT1还能显著降低SIRT1 mRNA及蛋白、Aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表达水平，显著提高TNF-α和IL-1β含量及acely-FOXO1蛋白水平，提示干扰SIRT1能够逆转褪黑素延缓椎间盘NPCs退变的作用。

综上所述，褪黑素能够通过上调SIRT1表达，抑制FOXO1乙酰化，减轻炎症反应，减少细胞凋亡，缓解椎间盘NPCs退变，而干扰SIRT1能逆转褪黑素的保护作用。但是褪黑素对椎间盘NPCs退变的作用机制较为复杂，尚需深入研究。