敲减Bloom综合征解旋酶基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

张 鹏，张 鑫，朱绪辉，李 涛，韩修武

膀胱癌是常见的泌尿系统肿瘤[1]，每年导致全球约15万人死亡[2]，其发生于尿路上皮细胞，因此主要发病类型为膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BLCA)，占比超过90%[3]。尽管目前BLCA有多种治疗方法，但效果欠佳，预后较差[2,4-5]，因此迫切需要研发有效的药物治疗。

RecQ家族主要参与DNA修复、重组、复制及转录等生理学过程[6-7]，其中BLM、WRN及RECQL4基因突变与Bloom、Werner和Rothmund-Thomson(RTS)相关[8-9]。BLM在同源重组修复、端粒维持和DNA复制等生理过程中起作用[10]。近期的研究发现，BLM参与端粒的延长，使用BLM抑制剂能有效抑制端粒延长，导致细胞凋亡或衰老[11]。在前列腺癌中干扰BLM表达可促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，从而减缓疾病进程[12]。但目前关于BLM在膀胱癌中作用的研究较少，本研究在体外以膀胱癌T24细胞系为研究对象，探究敲减BLM对细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1细胞培养 人正常膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1(对照组)、T24细胞系(膀胱癌细胞系)均从ATCC购买，于本实验室传代、保存。培养基分别选择Ham's F-12K(10%胎牛血清)和Macoy 5A(10%胎牛血清)，培养条件为37 ℃、5% CO2，当细胞汇集率达到80%～90%时传代。

1.2主要试剂和仪器 sh-BLM和sh-NC购自中国上海基因化学有限公司；Ham's F-12K、Macoy 5A培养基及胎牛血清(Gibco公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(Abcam)；兔抗人anti-β-Actin和BLM抗体分别购于Santa Cruz和CST公司；蛋白酶抑制剂购自Sigma公司；RIPA缓冲液和BCA Kit购自Thermo公司；TRIzol®试剂购自Invitrogen公司；MTT细胞增殖试剂盒购自Abcam公司；碘化丙啶(PI)购自Sigma-Aldrich，USA。流式细胞仪购自BD公司；二氧化碳(CO2)培养箱和超洁净工作台购自Thermo公司；蛋白电泳系统购自Invitrogen公司。

1.3方法

1.3.1GEPIA数据库:使用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)数据库分析BLM在BLCA中的转录水平[13]。进入数据库后在“Gene Expression Profile”中输入“BLM”；“Cancer name”选择“BLCA”;“Matched Normal data”选择“Match TCGA normal and GTEx data”；最后点击“Plot”，完成BLCA与非BLCA中BLM表达水平差异对比。非BLCA组28例，BLCA组404例。为进一步分析BLM在膀胱癌不同亚型中表达情况，比较了乳头状BLCA和非乳头状BLCA中BLM与非BLCA组的差异。

1.3.2T24细胞转染:实验共分为T24组(未转染)、T24+sh-NC组(转染sh-NC)、T24+shBLM组(转染sh-BLM)。转染过程如下：将短发夹RNA靶向BLM(sh-BLM)或非靶向序列对照(sh-NC)经LipofectamineTM2000转染T24细胞。sh-BLM(中国上海基因化学有限公司)基因序列为5'-AAGGAAGTTGTATGCACTA-3'；sh-NC: 5 '-ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA-3'。转染效力采用RT-qPCR验证。

1.3.3RT-qPCR检测:用TRIzol®试剂从组织或细胞中提取总RNA，采用STBR Green法检测BLM基因表达。PCR引物如下：BLM正向5'-GGATCCTGGTCCGC-3'，反向5'-CCTCAGTCAAATTT GCTCG-3'；β-actin正向5'-TGACGTGGACATCCGAAG-3'，反向5'-TCTTCATTGCTGGTGCC-3'。PCR循环条件如下：在95 ℃处初始变性15 min，然后采用两步PCR程序，在95 ℃处变性10 s，在60 ℃处退火/延伸32 s，共40个循环。所有样本以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法进行分析。

1.3.4Western blot检测： 细胞中加入RIPA缓冲液，震荡后室温静置10 min，离心取上清即为粗体蛋白溶液。BCA试剂盒测定蛋白质浓度。取30 μg蛋白在12.5% SDS-PAGE凝胶上跑胶，并将分离的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(NC)上。随后将膜放入一抗[BLM(1∶1000)、β-actin(1∶2500)]中孵育过夜，清洗后加入二抗(1∶2000)孵育1 h，再次清洗后加入显色液，扫胶仪中扫描拍照，以β-actin作为内参，计算BLM表达量。

1.3.5MTT比色法: 在96孔板中每孔分别接种3×103个T24膀胱癌细胞，培养48 h后，经MTT检测细胞存活率。在实验终止前4 h加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，孵育4 h后，在每孔中沿孔壁加入150 μl DMSO，震荡或吹打混匀后检测OD 490吸光度。

1.3.6流式细胞仪检测：细胞用0.05%胰蛋白酶进行消化，PBS充分清洗3次，每次2 min。然后用结合缓冲液重悬浮1×106个细胞，并在室温下与5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI 一起避光孵育15 min，随后上机检测。

2 结果

2.1BLCA肿瘤组织中BLM表达水平比较 与非BLCA组比较，BLCA组肿瘤组织中BLM表达水平显著上调(P<0.01)，其转录水平是对照组的2.4倍。按照BLCA分型进一步分析，乳头状BLCA和非乳头状BLCA BLM mRNA表达水平均高于非BLCA组(P<0.01)。见图1。

图1 BLCA与非BLCA患者BLM表达水平比较红色为BLCA组；灰色为非BLCA组；A.BLCA与非BLCA BLM转录水平;B.非乳头状BLCA与非BLCA转录水平;C.乳头状BLCA与非BLCA BLM转录水平;BLCA为膀胱尿路上皮癌,BLM为Bloom综合征解旋酶；与非BLCA组比较，aP<0.01

2.2T24细胞中BLM转录水平比较 T24细胞中BLM mRNA相对表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图2 对照组和膀胱癌细胞系组BLM表达水平比较对照组为SV-HUC-1；SV-HUC-1为人正常膀胱上皮永生化细胞，BLM为Bloom综合征解旋酶；与对照组比较，aP<0.01

2.3敲减BLM对BLM表达水平的影响 T24+sh-NC组与T24组BLM mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；T24+sh-BLM组BLM mRNA表达水平明显低于T24组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

图3 各组T24细胞系中BLM mRNA表达水平比较T24+sh-NC组为T24细胞转染sh-NC，T24+shBLM组为T24细胞转染sh-BLM；BLM为Bloom综合征解旋酶；与T24组比较，aP<0.01

2.4敲低BLM对T24细胞增殖能力的影响 T24+sh-NC组与T24组细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)；T24+sh-BLM组细胞增殖能力明显低于T24组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

图4 各组T24细胞增殖能力比较T24+sh-NC组为T24细胞转染sh-NC，T24+shBLM组为T24细胞转染sh-BLM；BLM为Bloom综合征解旋酶；与T24组比较，aP<0.01

2.5敲减BLM对T24细胞凋亡的影响 T24+sh-NC组与T24组细胞凋亡水平比较差异无统计学意义(P>0.05)； T24+sh-BLM组细胞凋亡率显著高于T24组(P<0.01)。见图5。

图5 各组T24细胞凋亡水平比较BT24+sh-NC组为T24细胞转染sh-NC，T24+shBLM组为T24细胞转染sh-BLM；BLM为Bloom综合征解旋酶；与T24组比较，aP<0.01

3 讨论

既往研究发现，乳腺癌、前列腺癌、肺癌和胃癌等中存在BLM基因高表达，降低其表达或生理活性是有效抑制肿瘤细胞增殖的手段[14]。在前列腺癌PC3细胞中也发现相同的现象，沉默BLM显著抑制了细胞的增殖，并促进了细胞凋亡[12]，还提高了丝裂霉素C的敏感性[15]。

本研究通过GEPIA数据库发现，乳头状BLCA和非乳头状BLCA中BLM转录水平均显著性升高；且T24组BLM mRNA表达水平高于对照组；在T24细胞系中，敲低BLM表达后抑制T24细胞增殖并促进T24细胞凋亡。上述研究结果证明BLM高表达与膀胱癌进程明显相关。既往研究发现，BLM参与细胞增殖和凋亡的调控，CRISPR/Cas9成功敲除MDA-MB-231细胞中BLM后，细胞增殖被抑制，而凋亡水平升高[16]。文献报道，低BLM表达增加化疗药物的敏感性[17]。ML216是BLM的DNA解链活性的有效抑制剂，在体外研究中发现，它可以靶向结合BLM，抑制其活性，诱导姐妹染色单体交换，增强细胞毒性药物的毒性[18]。甘草次酸处理BGC823胃癌细胞后BLM活性降低，细胞阻滞于G1/S期[19]；处理PC3膀胱癌细胞后BLM蛋白结构被破坏，Caspase3凋亡蛋白水平提高，细胞凋亡水平升高[20]。因此，推测经shRNA敲减膀胱癌细胞T24中BLM表达，可导致肿瘤细胞周期紊乱，干扰细胞增殖，抑制BLM表达或活性可能是膀胱癌治疗的潜在有效靶点。本研究解析了BLM高表达在膀胱癌中的作用，但是其深层次作用机制和分子机制需进一步研究。

综上所述，BLM在膀胱癌组织和T24细胞系中表达上调，敲减其表达抑制T24细胞增殖，促进细胞凋亡。BLM在膀胱癌疾病进程中可能发挥促进作用，抑制其表达是膀胱癌治疗的潜在靶点。