肝癌组织中SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化状态及与临床病理的关系

黎 蓓，马 艳，李 盈，程志祥

肝癌具易复发、转移特性，短期病死率高，5年生存率始终低于50%，我国肝癌年死亡数占世界肝癌年死亡数的45%。DNA甲基化是表观遗传学修饰方式，指DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5' 碳位共价键结合的一个甲基基团[1]。研究指出，抑癌基因启动子区CpG岛的高甲基化可以通过招募甲基化结合蛋白及相关复合物，改变染色质空间结构，阻止基因转录，使肿瘤抑制基因沉默，而此时相关基因的 DNA 序列并没有发生改变，因此肿瘤抑制基因启动子上的高甲基化与肿瘤形成密切相关[2]。多数肿瘤抑制基因都存在启动子区域异常甲基化，部分基因甲基化率甚至达80%。细胞因子信号转导抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS1)、谷胱甘肽S-转移酶P1(glutathione S-transferase P1, GSTP1)及Dickkopf相关蛋白3(Dickkopf-related protein 3, DKK3)均是抑癌相关基因[3-5]。现阶段SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化状态及与肝癌临床病理的关系报道较少。基于此，本研究回顾性分析了肝癌患者癌组织中SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化状态及与临床病理的关系，旨在为肝癌的生物标志物研究提供试验依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月—2019年12月在本院接受手术治疗的肝癌患者为研究对象。纳入标准：原发性肝癌，并有病理组织学诊断结果佐证；留存肝癌癌组织标本前无抗肿瘤治疗史。排除标准：转移性肝癌；合并内分泌疾病；合并免疫代谢性疾病。最终纳入肝癌70例，男54例，女16例；年龄37～82(58.40±11.22)岁；肿瘤直径≤5 cm者38例、>5 cm者32例。低分化14例，高-中分化56例；肿瘤包膜侵犯40例；肝外转移8例，门静脉癌栓6例，肝门淋巴结转移6例；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性56例；肝硬化44例；术前甲胎蛋白(AFP)阳性44例。选取同期行手术治疗的20例正常肝脏组织为对照组，包括肝血管瘤旁组织12例，肝外伤8例；术前检测HBsAg均为阴性且无肝硬化，术后病理证实为正常肝组织。

1.2仪器与试剂盒 DNA甲基化修饰、春华试剂盒均购自美国ZYMO RESEARCH公司；基因组DNA提取试剂盒、DNA引物由上海生工生物工程公司合成；PCR Mixture 2×Mix(BS-PCR002)购自上海Bil-serve公司；100 bp DNA Msarket购自日本Takkara公司；PCR扩增仪购自美国MJ公司；紫外线分光光度仪(Nano Drop2000)购自美国Thermo公司；台式高速离心机(5417R)购自德国Eppendorff公司；JS-380B全自动数码凝胶成像分析系统购自上海培清科技有限公司；多功能电泳仪(PowerBC-6002S1)购自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织标本采集：肝癌组织切除后避开出血坏死区域切癌组织，取距肝癌组织边缘5 cm以上的肝组织作为癌旁组织。肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织切除大小均为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm,液氮速冻放至-80 ℃冰箱保存待检。

1.3.2SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化状态检测：参照DNA提取试剂盒说明书步骤提取肝组织DNA，收集DNA溶液，ZYMO甲基化试剂盒修饰提取DNA，修饰后的DNA作为模板进行PCR扩增；PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s、72 ℃延伸30 s，循环数35个；72 ℃延长5 min，4 ℃时结束反应。同样方式将上述甲基化引物替换为非甲基化引物，退火温度调整至58 ℃再次进行非甲基化PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，凝胶成像分析目标基因的甲基化表达。

2 结果

2.1不同肝脏组织SOCS1、GSTP1、DKK3甲基化情况 正常肝组织未见SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化现象。肝癌组织SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化阳性率显著高于癌旁组织(P<0.01)。见表1。

表1 不同肝脏组织SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化情况[例(%)]

2.2肝癌组织SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化与临床病理的关系 HBsAg阳性肝癌患者SOCS1基因甲基化阳性率高于HBsAg阴性患者(P<0.01)；有血管侵犯的肝癌组织GSTP1基因甲基化阳性率高于无血管侵犯的肝癌组织(P<0.01)；有肝硬化的肝癌组织DKK3基因甲基化阳性率高于无肝硬化的肝癌组织(P<0.05)。见表2。

表2 70例肝癌组织SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化与临床病理的关系(例)

2.3肝癌组织SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化与临床病理的相关性分析 肝癌组织SOCS1基因甲基化与HBsAg呈正相关(r=0.401，P<0.01)；肝癌组织GSTP1基因甲基化与血管侵犯呈正相关(r=0.416，P<0.01)；DKK3基因甲基化与肝硬化呈正相关(r=0.243,P<0.05)。

3 讨论

DNA甲基化作为表观遗传学的主要修饰方式之一，其可通过甲基化调控基因表达以确保基因结构稳定性，与多种恶性肿瘤疾病的发生及发展有密切关联[6]。SOCS1最早被认为是炎性抑制因子，基于SOCS1的动物实验证实，其可增强动物对内毒素的耐受性，并通过间隔调控树突状细胞的转化成熟而避免机体过度免疫反应[7]。近年来，陆续有研究指出SOCS1可作为潜在的抑癌基因，在多种肿瘤组织中均存在低表达现象，其启动子CpG岛区域异常甲基化也在多种肿瘤组织中普遍存在，尤其是肝癌组织中[8]。本研究结果显示，在正常肝组织中并未见SOCS1基因甲基化，但肝癌组织、癌旁组织均存在甲基化，且肝癌组织甲基化阳性率高于癌旁组织；同时，HBsAg阳性的肝癌组织SOCS1基因甲基化阳性率显著更高，且两者有显著相关性。与既往文献一致。肝癌的发生与肝炎病毒有着密不可分的关系，有研究报道病毒性肝炎相关肝细胞癌的肝癌组织中抑癌基因启动子CpG岛甲基化频率要明显高于非病毒相关性肝癌[9]。

GSTP1最早在人胎盘细胞中被发现，而后研究证实其在肾脏、肺组织中均有表达，可代谢多种致癌化合物，从而避免细胞DNA损伤和抑癌基因激活[10-11]。邢红宇等[12]报道，GSTP1基因可能成为诊断前列腺癌的可靠生物标志物，指出GSTP1基因启动子甲基化可能造成GSTP1基因低表达，与前列腺癌发病率密切相关。而本研究结果显示，在正常肝组织中并未见GSTP1基因甲基化，但肝癌组织、癌旁组织均存在甲基化，且肝癌组织甲基化阳性率高于癌旁组织。由此可见，GSTP1甲基化或与肝癌发病存在一定关联。本研究结果还显示，存在血管侵犯的肝癌组织GSTP1甲基化阳性率高于无血管侵犯的肝癌组织，GSTP1基因甲基化仅与肝癌血管侵犯存在显著相关性。

DKK3属Dickkopf家族成员，是新抑癌基因，也是经典Wnt信号转导通路的拮抗因子。有研究证实，多种恶性肿瘤疾病均存在DKK3 mRNA转录下调/表达缺失现象，DKK mRNA缺失参与肿瘤的发生与发展[13]。DKK3基因启动子区富含CpG岛，而启动子区CpG岛的高甲基化则是导致抑癌基因失活的重要机制之一。DKK3在多种恶性肿瘤中失活，并伴随启动子区CpG岛甲基化，通常作为抑癌基因发生抗肿瘤作用[14]。本研究结果显示，正常肝组织未见DKK3基因启动子区甲基化现象，但肝癌组织、癌旁组织均存在甲基化现象，且肝癌组织DKK3基因甲基化阳性率显著高于癌旁组织。与宋国栋等[15]研究结论一致。但本研究中仅合并肝硬化的肝癌组织DKK3基因甲基化阳性率显著高于未合并肝硬化的肝癌组织，Spearman相关性分析也证实肝癌组织DKK3基因甲基化与肝硬化显著相关。

综上所述，肝癌组织存在SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化现象，且SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化与HBsAg阳性、血管侵犯、肝硬化显著相关。但本研究也存在一定局限性，在临床病理资料采集上存在一定不足之处，拟在下阶段采集更多病理特征后进一步补充及完善。