miR-129-5p对LPS引起星形胶质细胞炎性介质释放的影响和机制

丁秀丽 祁秀丽 王誉霖

阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病严重威胁着人们的生命健康和生活质量，这些中枢神经系统疾病的发生与炎症关系密切[1]。星形胶质细胞具有营养神经元、支持神经元、免疫调节以及信号传递的作用，其是胶质细胞中分布最广泛、体积最大的一类细胞[2]。研究显示，星形胶质细胞炎症发生与细胞内基因表达有关，并且这些基因可能是改善炎症的重要靶标[3]。miRNA是在真核生物体内具有多种生物学作用的非编码RNA，其没有开放阅读框，大小约为22个核苷酸，参与调控细胞分化、衰老、代谢等过程[4]。miRNA能够通过影响下游靶基因的表达影响多个病理、生理过程[5]。研究报道显示，miR-129-5p参与肿瘤、动脉粥样硬化等疾病发生[6,7]。既往的文献显示，上调miR-129-5p能够减轻阿尔茨海默病大鼠神经损伤，抑制炎症发生[8]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)是一个在各种细胞中表达的DNA结合蛋白，在组织损伤中发挥促进作用，其表达上调后可以诱导炎症发生[9]。在星形胶质细胞中发现，HMGB1表达升高后细胞释放炎性因子水平升高，HMGB1是一个促星形胶质细胞炎性因子[10]。本实验探讨miR-129-5p对脂多糖(lipopolysaccharides， LPS)诱导的星形胶质细胞炎性介质的影响和机制，为临床上靶向基因抑制神经性炎症提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 出生2 d的SD大鼠由辽阳森科生物工程有限公司提供；HMGB1抗体购自美国GeneTex；miR-129-5p mimics和mimics control由百奥迈科生物技术有限公司构建；引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成；LPS购自北京索莱宝科技有限公司；IL-6检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；IL-1β检测试剂盒购自上海纪宁酶联科技有限公司；TNF-α检测试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司；NO检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；WT和MUT由上海康颜生物科技有限公司构建。

1.2 星形胶质细胞分离培养 在无菌条件下取大鼠大脑皮层组织，放在含有D-Hanks液的培养液皿内，在显微镜下取出脑膜、血管组织并弃掉，收集大脑皮层组织，用D-Hanks液洗涤2次。用眼科剪把大脑皮层组织剪碎成大小约为1 mm3的组织块，在组织中添加0.125%的胰蛋白酶，放在37℃消化。用200目的网筛过滤，在4℃，3 000 r/min离心5 min，将上清溶液弃掉，将细胞悬浮在10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM细胞培养液中，种植到细胞培养皿内，细胞接种密度为6×104个/cm2，放在37℃，5%CO2培养箱中培养，9 d后，将细胞放在37℃的恒温振荡器上，以260 r/min结合18 h。将脱落的细胞弃掉，此时贴壁的细胞为星形胶质细胞。以0.25%的胰蛋白酶消化传代，种植到细胞培养瓶内继续培养，取第3代细胞用于后续实验。

1.3 细胞转染和分组处理 星形胶质细胞中转染miR-129-5p mimics和mimics control，细胞转染方法完全按照Lipofectamine 2000转染试剂操作说明进行。将转染miR-129-5p mimics和mimics control后的星形胶质细胞以含有1 μg/ml的LPS细胞培养液中培养，记为miR-129-5p+LPS和miR-NC+LPS组。以没有转染的星形胶质细胞用含有1 μg/ml的LPS细胞培养液培养，记为LPS组。以没有处理的星形胶质细胞作为空白对照，记为Control组。

1.4 miR-129-5p表达检测 用qRT-PCR方法测定miR-129-5p表达，步骤如下：收集培养1 d以后的Control、LPS、miR-NC+LPS、miR-129-5p+LPS组细胞，在细胞中添加TRizol试剂，提取细胞总RNA，以NanoDrop检测RNA样品的浓度和纯度。配制反转录体系：1 μl的dT primer、2 μg的RNA、2 μl的Random primer，补足DEPC水至13 μl，放在70℃孵育10 min，放在冰上静置5 min，然后再添加2 μl的dNTP、4 μl的RT-buffer、0.5 μl的RTase、0.5 μl的inhibitor，此时总体积为20 μl，放在25℃孵育10 min，50℃孵育60 min，90℃孵育5 min，4℃孵育1 min。配制PCR体系，包括：0.5 μl的上下游引物、1 μl的cDNA、10 μl的LightCycler 480 SYBR GreenI，添加DEPC水至20 μl。PCR引物为：miR-129-5p F:5’-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3’，R:5’-AAGCCCAGACCGCAAAAAGUU-3’；U6 F:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。U6为内参，按照2-ΔΔCt法计算miR-129-5p表达水平。

1.5 IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平检测 收集培养1 d以后的Control、LPS、miR-NC+LPS、miR-129-5p+LPS组细胞培养液上清，以ELISA法测定IL-6、IL-1β、TNF-α水平，步骤完全按照IL-6检测试剂盒、IL-1β检测试剂盒、TNF-α检测试剂盒说明进行；以Griess法检测NO水平，步骤完全按照NO检测试剂盒说明进行。

1.6 miR-129-5p靶基因预测和鉴定 利用生物信息学软件(targetscan)预测miR-129-5p的靶基因，发现miR-129-5p和HMGB1的3’UTR端有结合位点。以荧光素酶报告系统鉴定二者的靶向关系：将WT、MUT分别与miR-129-5p mimics、mimics control共转染到星形胶质细胞中，培养1 d，以荧光素酶活性检测试剂盒测定荧光素酶活性变化。WT、MUT分别为野生型(含有HMGB1的3’UTR端结合位点)、突变型(含有突变HMGB1的3’UTR端结合位点)荧光素酶报告载体。

1.7 HMGB1蛋白表达检测 以Western blot方法检测HMGB1蛋白表达，步骤如下：收集培养1 d以后的Control、LPS、miR-NC+LPS、miR-129-5p+LPS组细胞，在细胞中添加蛋白抽提试剂，放在冰上充分裂解20 min以后，收集裂解试剂，在4℃，12 000 r/min离心10 min，吸取蛋白上清溶液，以BCA方法测定蛋白浓度。在蛋白样品中添加5×Loading Buffer充分混合以后，放在100℃孵育15 min。在SDS-PAGE凝胶中添加30 μg蛋白样品，SDS-PAGE凝胶采用5%的浓缩胶和10%的分离胶，设置100 V的电压电泳，肉眼观察染料进入到凝胶的底部以后，停止电泳，取出凝胶。将凝胶放在转移缓冲液中浸泡10 min。转膜电压设置为70 V，转膜时间为40 min，转膜装置放在冰上进行。取出NC膜，以5%的脱脂奶粉封闭以后，放在1∶1 000稀释以后的一抗反应液中，在4℃的环境中孵育过夜，然后将NC膜放在1∶4 000稀释以后的二抗溶液中，放在室温中结合2 h。在NC膜上滴加ECL显色试剂。β-actin作为参照，分析HMGB1蛋白表达变化。

1.8 HMGB1对miR-129-5p影响细胞炎性介质释放的作用检测 分别将miR-129-5p mimics、pcDNA3.1和miR-129-5p mimics、pcDNA3.1-HMGB1共转染到星形胶质细胞中，然后以1 μg/ml的LPS细胞培养液培养，记为miR-129-5p+NC+LPS组和miR-129-5p+HMGB1+LPS组，按照1.5中方法检测细胞培养液中IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平，按照1.7中方法检测细胞中HMGB1蛋白表达。

2 结果

2.1 miR-129-5p mimics提高LPS条件下星形胶质细胞中miR-129-5p表达水平 LPS组细胞中miR-129-5p表达水平低于Control组(P<0.05)；miR-129-5p+LPS组细胞中miR-129-5p表达水平高于miR-NC+LPS组(P<0.05)。miR-129-5p mimics提高LPS条件下星形胶质细胞中miR-129-5p表达水平。见表1。

表1 miR-129-5p mimics转染后LPS诱导的星形胶质细胞中miR-129-5p表达水平

2.2 miR-129-5p mimics抑制LPS条件下星形胶质细胞炎性介质释放 LPS组细胞培养液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平高于Control组(P<0.05)；miR-129-5p+LPS组细胞培养液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平低于miR-NC+LPS组(P<0.05)。miR-129-5p mimics抑制LPS条件下星形胶质细胞炎性介质释放。见表2。

表2 miR-129-5p mimics转染后LPS诱导的星形胶质细胞释放IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平

2.3 miR-129-5p和HMGB1靶向关系预测和鉴定 生物信息学软件发现miR-129-5p和HMGB1的3’UTR端有结合位点。miR-129-5p mimics和WT共转染后的细胞荧光素酶活性下降。miR-129-5p和HMGB1互为靶向关系。见图1，表3。

图1 生物信息学软件预测miR-129-5p和HMGB1靶向关系

表3 细胞荧光素酶活性

2.4 miR-129-5p mimics抑制LPS条件下星形胶质细胞中HMGB1蛋白表达 LPS组细胞中HMGB1蛋白表达水平高于Control组(P<0.05)；miR-129-5p+LPS组细胞中HMGB1蛋白表达水平低于miR-NC+LPS组(P<0.05)。miR-129-5p mimics抑制LPS条件下星形胶质细胞中HMGB1蛋白表达。见表4，图2。

表4 miR-129-5p mimics转染后LPS诱导的星形胶质细胞中HMGB1蛋白水平

2.5 pcDNA3.1-HMGB1逆转miR-129-5p mimics对LPS条件下星形胶质细胞炎性介质释放的抑制作用 miR-129-5p+HMGB1+LPS组细胞中HMGB1蛋白表达水平和细胞释放IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平均高于miR-129-5p+NC+LPS组，差异有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3.1-HMGB1逆转miR-129-5p mimics对LPS条件下星形胶质细胞炎性介质释放的抑制作用。见图3，表5。

图2 Western blot检测miR-129-5p mimics转染后LPS诱导的星形胶质细胞中HMGB1蛋白表达

图3 Western blot检测miR-129-5p mimics和pcDNA3.1-HMGB1共转染后细胞中HMGB1蛋白表达

表5 miR-129-5p mimics和pcDNA3.1-HMGB1共转染后LPS诱导的星形胶质细胞中HMGB1蛋白水平和细胞释放IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平

3 讨论

星形胶质细胞具有调节中枢神经系统的作用，其受到外界因素刺激以后可以释放多种炎性因子，促进炎性反应[11]。IL-6、IL-1β、TNF-α是促炎性因子，其有调节免疫和诱导炎症的作用，IL-6、IL-1β、TNF-α在多种神经炎症性损伤中高表达[12]。NO是重要的免疫调节因子，其可以调控中性粒细胞、巨噬细胞活性，对中枢神经系统神经递质以及突触可塑性等有调控作用[13]。研究显示，NO与阿尔茨海默病、帕金森综合征等中枢神经系统疾病关系密切，NO可以作为促炎因子参与炎性反应的病理损伤发生，如DNA破坏、蛋白激酶硝酰化[14,15]。本实验结果显示，LPS刺激以后的星形胶质细胞培养液上清中的IL-6、IL-1β、TNF-α、NO含量均升高，提示LPS刺激星形胶质细胞炎性介质释放，这为我们研究miR-129-5p在星形胶质细胞炎症中的作用提供了基础。

miRNA没有开放阅读框，也没有编码蛋白质的作用，在人体内的不同组织、不同细胞中均有表达，miRNA参与不同阶段生理、病理过程，miRNA是一个重要的调控因子[16]。目前的研究表明，miRNA不仅与胚胎发育等正常生理过程有关，还与人类多种疾病进展关系密切[17]。miRNA和人类肿瘤、肺炎、缺血再灌注损伤等发生均有关，并且miRNA还可能是疾病治疗的分子靶点[18-20]。miRNA还参与中枢神经系统疾病的发生，在缺氧复氧脑损伤、阿尔茨海默病等疾病中均发现miRNA的异常表达，miRNA还参与调控疾病的进展[21,22]。以前的研究显示，miR-129-5p与肿瘤、椎间盘退变等有关，miR-129-5p可能是疾病治疗的靶点[23,24]。研究表明，miR-129-5p参与阿尔茨海默病发生，并且上调miR-129-5p能够抑制阿尔茨海默病大鼠神经炎症[8]。本实验发现，LPS刺激以后的星形胶质细胞中miR-129-5p表达水平降低，并且上调miR-129-5p后的星形胶质细胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、NO减少，提示上调miR-129-5p抑制星形胶质细胞炎性介质释放，这与以前的研究结果相符合，均说明miR-129-5p有抗神经炎症的作用。

本次实验还进一步探讨了miR-129-5p的作用机制，发现miR-129-5p与HMGB1互为靶向关系，并且上调miR-129-5p可以抑制LPS条件下星形胶质细胞中HMGB1的表达。HMGB1是一个非组蛋白，其脓毒症、关节炎、肺炎等炎症疾病中发挥作用[25]。以前的研究发现，HMGB1参与神经炎症发生，其在星形胶质细胞炎症中高表达，并且下调其表达可以改善炎症[10,26]。本实验显示，HMGB1可以逆转上调miR-129-5p对LPS条件下星形胶质细胞炎性介质释放的抑制作用，提示上调miR-129-5p通过靶向HMGB1发挥抗炎作用。

总而言之，miR-129-5p在星形胶质细胞炎症中可能发挥抑制作用，上调其表达可以通过靶向抑制HMGB1减少LPS引起的星形胶质细胞炎性介质释放，这为研究神经炎症发生机制提供了资料，为靶向基因抑制神经炎症发生提供了参考方向。以后会继续研究miR-129-5p可能的其他作用机制和下游靶向调控机制。