麻黄碱对LPS诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡、炎症和COX-2基因表达的影响

邵春芝 陈静 王栋宇 王君

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是临床上常见的危重症，脓毒症、创伤、电击和吸入有害气体等多种因素都可能导致ALI，其中脓毒症是常见的因素[1]。研究证明，严重感染后，一些患者会发生某些反应，包括促炎信号通路的激活和炎性介质的过度表达，导致全身性炎性反应，最终导致严重休克，多器官衰竭和死亡[2,3]。越来越多的证据表明，过度炎性反应和氧化应激是ALI的主要发病机制[4,5]。因此，开发预防和(或)治疗脓毒症诱导的ALI的有效方法显得尤为重要。肺泡上皮充当保护肺部免受吸入物质影响的屏障。有研究显示，肺泡上皮细胞的异常凋亡与ALI密切相关[6]。文献指出，环氧化酶-2(COX-2)是前列腺素物质合成过程中的一种限速酶，参与多种炎症性疾病，其中包括AIL[7]。因此，有效抑制肺泡上皮细胞凋亡、炎性反应及氧化应激对ALI伤的治疗至关重要。麻黄具有宣肺平喘、发汗解表等功效，常用于治疗咳喘病，麻黄碱是麻黄的主要成分。研究显示，麻黄碱能够抑制气道炎症、气道重塑以及支气管哮喘等[8,9]。目前关于麻黄碱对脓毒症性ALI的影响笔者所见尚未报道。本实验探讨麻黄碱对脂多糖诱导的肺泡上皮细胞凋亡、炎症以及COX-2基因表达的影响，以期为麻黄碱用于ALI的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺泡上皮细胞A549(中国科学院上海生科院细胞资源中心)；盐酸麻黄碱(中国食品药品检定研究院)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；胰蛋白酶(美国Abcam公司)；CCK-8试剂(日本同仁化学研究所)；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA检测试剂盒(深圳达科为生物技术有限公司)；Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(日本TaKaRa公司)；ROS、MDA和SOD检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和COX-2单抗(美国Affinity Biosciences公司)；辣根过氧化酶标记的IgG二抗(美国Santa Cruz公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；ECL化学发光试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司)。

1.2 细胞培养 肺泡上皮细胞A549复苏后培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，放置在5% CO2、饱和湿度、37℃培养箱中，观察细胞生长状况，每隔1 d更换1次新的培养液，细胞贴壁生长汇合至80%时进行传代，取对数增殖期的细胞进行后续实验。

1.3 细胞分组和处理 对数期的肺泡上皮细胞A549以1×105个/孔接种至24孔板中，于37℃培养箱中过夜培养，细胞贴壁生长融合至50%时加入10 μg/ml LPS进行干预，设10 μg/ml LPS干预的A549细胞为LPS组，10 μg/ml LPS 和800 μg/ml麻黄碱干预的A549细胞为Ephedrine组，不做任何处理的A549细胞为对照Control组，3组细胞作用24 h，收集细胞及细胞上清液，进行后续相关指标实验检测。

1.4 qRT-PCR检测 在24孔板中接种肺泡上皮细胞A549，每孔接种1×106个/孔，按照1.3分组处理24 h后，以胰酶消化并收集细胞，采用Trizol法提取抽提细胞总RNA，将RNA逆转录合成第一链cDNA，采用cDNA作为模板，β-actin作为内参，在荧光定量PCR仪上进行扩增，反应结束获得数据以2-ΔΔCt法分析基因的相对表达情况。所有引物。COX-2 F 5’-GTCTGATGATGTATGCCACAATCTG-3’；R 5’-GATGCCAGTGATAGAGGGTGTTAAA-3’。β-actin F 5’-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’；R 5’-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’。

1.5 CCK-8实验 对数期的肺泡上皮细胞A549种植到96孔板中，种植密度为1×105个/孔，于37℃培养箱继续培养，以1.3分组处理，在处理24、48、72 h时于每孔中避光添加10 μl MTT溶液，37℃培养箱孵育4 h，弃去细胞上清液，于每孔中添加150 μl二甲基亚砜溶液，充分混匀，振荡反应至结晶沉淀完全溶解，放入全自动酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)，波长设置为490 nm。

1.6 流式细胞术检测 收集对数期的肺泡上皮细胞A549，调整细胞密度为1×105个/ml，于6孔板中进行种植，每孔2 ml，以1.3分组处理，于常规培养箱连续培养24 h，弃细胞上清液，收集细胞，加入500 μl Binding Buffer重悬细胞，添加5 μl AnnexinⅤ-FITC混匀，再加入5 μl PI，混匀后室温避光孵育10～15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 ELISA检测 肺泡上皮细胞A549分组处理后，收集细胞上清液，采用ELISA试剂盒分别检测3组细胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具体步骤严格按照ELISA试剂盒使用说明书进行操作。

1.8 SOD活力和MDA含量检测 肺泡上皮细胞A549分组处理后，收集细胞上清液，采用硫代巴比妥酸法测定MDA的含量，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活力，具体方法见MDA和SOD检测试剂盒使用说明书。

1.9 ROS水平检测 收集处理后的3组肺泡上皮细胞A549，与5 μmol/L的DCFH-DA工作液混匀，放置在37℃培养箱孵育10 min，参照ROS检测试剂盒说明测定ROS水平。

1.10 Western blot实验 使用RIPA细胞裂解液抽提细胞中的总蛋白，经BCA法对蛋白浓度进行定量，向蛋白样品中加入5×上样缓冲液，金属浴致蛋白质变性。制备SDS-PAGE凝胶，电泳分离蛋白，随后转移到PVDF膜上，放置在5%脱脂奶粉中室温封阻1 h，孵育相应一抗(Cleaved Caspase-3一抗1∶500稀释，Cleaved Caspase-9一抗1∶500稀释，COX-2一抗1∶800稀释)，4℃过夜，次日加入二抗(1∶2 00稀释)，室温孵育2 h，加入ECL发光试剂进行显色，于暗室中曝光、采集蛋白条带图像，以β-actin作内参，分析目的蛋白灰度值，计算蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 麻黄碱对LPS诱导的A549细胞增殖能力的影响 与Control组相比，LPS组肺泡上皮细胞A549在24、48和72 h时增殖能力均明显降低(P<0.05)；与LPS组相比，Ephedrine组A549细胞在各时间点增殖能力均明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 3组肺泡上皮细胞A549在24、48和72 h时OD值比较

2.2 麻黄碱对LPS诱导的A549细胞凋亡能力的影响 与Control组相比，LPS组肺泡上皮细胞A549凋亡率明显升高(P<0.05)；与LPS组相比，Ephedrine组A549细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。见表2，图1。

表2 3组肺泡上皮细胞凋亡率比较

图1 流式细胞术检测各组肺泡上皮细胞A549的凋亡率

2.3 麻黄碱对LPS诱导的凋亡相关蛋白表达的影响 与Control组相比，LPS组肺泡上皮细胞A549中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达明显上调(P<0.05)；与LPS组相比，Ephedrine组A549细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达明显下调(P<0.05)。见表3，图2。

表3 3组肺泡上皮细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表达比较

图2 Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达

2.4 麻黄碱对LPS诱导的炎性因子分泌的影响 与Control组相比，LPS组肺泡上皮细胞A549上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明显增多(P<0.05)；与LPS组相比，Ephedrine组A549细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显减少(P<0.05)。见表4。

表4 3组肺泡上皮细胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量比较

2.5 麻黄碱对LPS诱导的氧化应激的影响 与Control组相比，LPS组肺泡上皮细胞A549中MDA含量增多(P<0.05)，ROS水平升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；与LPS组相比，Ephedrine组A549细胞中MDA含量减少(P<0.05)，ROS水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)。见表5。

表5 3组肺泡上皮细胞中MDA含量、ROS水平和SOD活性比较

2.6 麻黄碱对LPS诱导的COX-2表达的影响 与Control组相比，LPS组肺泡上皮细胞A549中COX-2 mRNA和蛋白表达均明显升高(P<0.05)；与LPS组相比，Ephedrine组A549细胞中COX-2 mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05)。见表6，图3。

表6 3组肺泡上皮细胞中COX-2 mRNA和蛋白表达比较

图3 Western blot检测COX-2蛋白表达

3 讨论

ALI的特征是富含蛋白质的水肿液在肺泡隔室中积聚。ALI的机制因病因而异，例如血管通透性增加，细胞因子过度生产，白细胞募集和表面活性剂功能障碍，导致间质和肺泡肺水肿、肺泡塌陷和低氧血症[10]。上皮和内皮细胞的损伤在ALI的发展中起着重要作用。上皮的完整性和通透性通过细胞层之间的紧密连接而得以紧密保持，这允许细胞与细胞之间的通讯，但阻止吸入的有害物质的进入[11]。

LPS是革兰阴性细菌的主要成分，是感染疾病中的主要促炎反应因子之一，可导致体内外的过度炎性反应[12]。据报道LPS是引起炎性反应的主要因素之一，LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤模型已被广泛用于脓毒症相关的ALI的机制研究[13,14]。在ALI模型中，LPS显著增加了包括TNF-α，IL-1β和IL-6在内的炎性细胞因子的产生，这已被证明与ALI的发展有关[15]。

在本研究中，根据Zhu等[16]的研究，通过用10 μg/ml的LPS刺激肺泡上皮细胞A549创建了类似的脓毒症性ALI细胞模型，结果显示，LPS诱导的A549细胞增殖活力明显降低，凋亡率明显升高，凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达明显上调，炎性因子TNF-α，IL-1β和IL-6的分泌增多，该发现与先前的研究[16]一致，表明成功建立了LPS诱发的ALI细胞模型。

麻黄碱是从传统中药麻黄的主要活性成分，具有广泛的抗氧化和抗炎的作用[17]。本实验根据前期实验结果通过800 μg/ml麻黄碱干预LPS诱导的A549细胞，结果显示，细胞增殖活力升高，凋亡率下降，Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达下调，TNF-α，IL-1β和IL-6的含量减少，表明麻黄碱能够逆转LPS诱导的A549细胞凋亡及炎性反应，对LPS诱导的A549细胞具有保护作用。

此外，本实验结果显示，LPS诱导的A549细胞中MDA含量增多，ROS水平增加，而SOD活性降低，而麻黄碱能够逆转LPS诱导的A549细胞中ROS水平、MDA含量和SOD活性。研究显示，脓毒症诱导的ALI中ROS水平升高，过量的ROS又可促进局部炎性反应，进而导致肺组织的进一步损伤[18]。

SOD是机体内非常重要的抗氧化酶，能够有效清除机体内的氧自由基，增加抗氧化能力。MDA是一种过氧化产物，其含量的高低间接反应细胞损伤程度。ALI中肺组织中SOD活力降低，MDA含量上升[19]。本实验结果与以往的研究[18,19]一致，提示麻黄碱能够通过抑制氧化应激对LPS诱导的肺泡上皮细胞A549起保护作用。研究表明，在正常肺组织中COX-2基因的表达量较低，而在ALI的肺组织中COX-2的表达急剧上升，COX-2基因参与ALI发病过程[20]。有研究显示，在ALI中，抑制COX-2的表达可有效减轻肺组织的炎性反应[21]。

本实验发现，LPS能够上调A549细胞中COX-2的表达，麻黄碱能够下调LPS诱导的COX-2的表达。这提示麻黄素对LPS处理的A549细胞炎性反应的抑制作用可能通过下调COX-2的表达来实现，然而该推测仍需后续进行验证。

综上所述，麻黄碱能够抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡、炎性反应及氧化应激，并下调COX-2基因的表达，为麻黄碱用于ALI的临床治疗提供实验依据。