重楼皂苷Ⅱ对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响

游丽娇，孙芳园，杨小芳，耿欢，雷鸣

重楼皂苷Ⅱ对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响

游丽娇，孙芳园，杨小芳，耿欢，雷鸣

上海中医药大学附属第七人民医院，上海 200137

观察重楼皂苷Ⅱ对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。不同浓度重楼皂苷Ⅱ作用于A549细胞48 h，CCK-8法检测细胞存活率；将细胞分为对照组和重楼皂苷Ⅱ低、中、高剂量组，JC-10荧光探针检测线粒体膜电位（MMP），Fluo-4 AM荧光探针检测细胞内Ca2+水平，DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平，Western blot检测细胞内Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表达。与对照组比较，各浓度重楼皂苷Ⅱ可降低A549细胞存活率，差异均有统计学意义（＜0.01）；重楼皂苷Ⅱ低、中、高剂量组A549细胞MMP显著降低，Ca2+、ROS水平显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低，重楼皂苷Ⅱ高剂量组Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义（＜0.05）。重楼皂苷Ⅱ可能通过降低细胞MMP，提高细胞内Ca2+水平，增加细胞内ROS含量，调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3表达，促进A549细胞凋亡。

非小细胞肺癌；重楼皂苷Ⅱ；A549细胞；线粒体；凋亡

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的85%，是全球癌症死亡的主要原因[1]。早期诊断和治疗虽然有效，但由于化学抗癌药物的毒性和耐药性，故亟需探索和开发更安全、有效的抗癌药物[2]。近年来，从中药中提取天然的抗癌活性成分受到广泛关注。研究报道，中药有效成分可通过诱导癌细胞凋亡、改变细胞周期、免疫修饰和抑制炎症发挥抗癌活性[3-4]。线粒体是传递凋亡信号的主要细胞器，细胞凋亡过程中，细胞内Ca2+、活性氧（ROS）水平和线粒体膜电位（MMP）变化是线粒体功能障碍的主要事件[5]。因此，靶向线粒体途径有望成为抗肿瘤药物筛选的主要策略。重楼皂苷Ⅱ是从重楼中提取的天然三萜类活性成分，已有研究显示，多种三萜类化合物可促进癌细胞凋亡[6]。本研究观察重楼皂苷Ⅱ对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物和细胞

重楼皂苷Ⅱ，成都普菲德生物公司，纯度＞98%，批号76296-72-5。人非小细胞肺癌A549细胞，中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

RPMI 1640培养基（货号MA0315）、FBS（货号PWL001）、青链霉素（货号MA0110）、CCK-8细胞存活率检测试剂盒（货号MAO218）、JC-10荧光探针（货号MB6097）、Fluo-4 AM钙离子荧光探针（货号MA0196）、DCFH-DA ROS荧光探针（货号MB4682）、Hoechst 33342染色剂（货号MB3210）和PBS（货号MA0015），大连美仑生物；Bax（货号5023S）、Bcl-2（货号3498S）、cleaved Caspase-3（货号9661S）和β-actin（货号8457S）一抗，美国CST公司。CO2培养箱（美国Thermo Scientific公司），倒置显微镜（德国徕卡），超净工作台（美国Thermo Scientific公司），纯水仪（美国Millipore公司），MQ05267多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司），高内涵细胞分析仪（美国GE），电泳仪和转膜仪（美国Bio-Rad），Amersham Imager 600蛋白成像仪（美国GE）。

1.3 细胞培养及分组

A549细胞用含10%FBS和1%青链霉素的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。将细胞分为对照组和重楼皂苷Ⅱ低、中、高剂量组，根据细胞存活率检测结果，选择细胞存活率为50%（IC50）时的浓度作为中剂量，2倍IC50浓度为高剂量，1/2 IC50浓度为低剂量，每组设5个复孔。

1.4 细胞存活率测定

取对数生长期A549细胞，以5×l03个/孔细胞密度接种于96孔板中培养过夜；分别以终浓度为0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L重楼皂苷Ⅱ处理细胞48 h，另设对照组（有细胞，无药物干预）和空白孔（无细胞，只加入培养基）；48 h后各孔加入10 μL CCK-8溶液培养1 h，于酶标仪波长450 nm处检测吸光度（OD值），计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（实验组OD值－空白孔OD值）÷（对照组OD值－空白孔OD值）×100%。

1.5 线粒体膜电位检测

将A549细胞按5×103个/孔接种于96孔板中培养过夜，分别用低、中、高剂量重楼皂苷Ⅱ培养48 h；PBS洗涤2次，将JC-10试剂和Hoechst 33342染色液均以1∶200加入PBS中，配制JC-10工作液，每孔加100 μL JC-10工作液，37 ℃培养箱中避光孵育45 min，使用高内涵细胞分析仪分析数据并拍照，以红绿荧光比值计算MMP。

1.6 Ca2+水平检测

将A549细胞以5×103个/孔接种于96孔板中培养过夜，分别用低、中、高剂量重楼皂苷Ⅱ培养48 h；PBS洗涤2次，将Fluo-4 AM试剂和Hoechst 33342染色液分别以1∶800、1∶200加入PBS中，配制Fluo-4 AM工作液，每孔加100 μL工作液，37 ℃培养箱中避光孵育45 min，使用高内涵细胞分析仪分析数据并拍照，以绿色荧光强度表示Ca2+水平。

1.7 活性氧水平检测

将A549细胞以5×103个/孔接种于黑色透底96孔板中培养过夜，分别用低、中、高剂量重楼皂苷Ⅱ培养48 h；PBS洗涤2次，将DCFH-DA试剂和Hoechst 33342染色液分别以1∶1 000、1∶200加入PBS中配制DCFH-DA工作液，每孔加100 μL工作液，37 ℃培养箱中避光孵育45 min，多功能酶标仪于激发波长488 nm、发射波长530 nm处测量各孔OD值，计算ROS含量。

1.8 Western blot检测

取对数生长期A549细胞，以2×105个/mL密度接种于6孔板中培养过夜，分别用低、中、高剂量重楼皂苷Ⅱ培养48 h；RIPA裂解液冰上裂解，提取总蛋白，BCA法蛋白定量；按照上样浓度比例加入5×蛋白上样缓冲液，金属浴95 ℃、10 min使蛋白变性；经PAGE后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h；用一抗稀释液按1∶1 000比例稀释Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3一抗，4 ℃孵育过夜；1×TBST洗涤3次，每次10 min；室温孵育二抗2 h，1×TBST洗涤3次，每次10 min，ECL成像采集图像，采用Image J软件对条带进行灰度分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 重楼皂苷Ⅱ对A549细胞存活率的影响

与对照组比较，各浓度重楼皂苷Ⅱ显著降低细胞存活率（＜0.01）。重楼皂苷Ⅱ浓度为1 μmol/L时，A549细胞存活率为50%，故选择1 μmol/L作为中剂量、2 μmol/L作为高剂量、0.5 μmol/L作为低剂量进行后续实验。结果见图1。

注：与对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001

2.2 重楼皂苷Ⅱ对A549细胞线粒体膜电位的影响

当MMP正常时，JC-10聚集在线粒体基质中，形成聚合物，产生红色荧光；当MMP降低时，JC-10从线粒体基质释放到胞浆中，此时JC-10为单体，产生绿色荧光。结果显示，对照组红色荧光较强，表明MMP较高；与对照组比较，重楼皂苷Ⅱ低、中、高剂量组红色荧光减弱，绿色荧光增强，红绿荧光比值降低，提示MMP下降，差异有统计学意义（＜0.05）。结果见图2。

注：A.对照组；B.重楼皂苷Ⅱ低剂量组；C.重楼皂苷Ⅱ中剂量组；D.重楼皂苷Ⅱ高剂量组；与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 重楼皂苷Ⅱ对A549细胞Ca2+水平的影响

Fluo-4 AM进入细胞后被酯酶剪切形成Fluo-4，从而滞留在细胞内，Fluo-4可与细胞内的Ca2+结合，产生绿色荧光。结果显示，对照组绿色荧光较弱，表明Ca2+水平较低。与对照组比较，重楼皂苷Ⅱ低、中、高剂量组绿色荧光明显增强，细胞内Ca2+水平显著升高，差异有统计学意义（＜0.001）。结果见图3。

注：A.对照组；B.重楼皂苷Ⅱ低剂量组；C.重楼皂苷Ⅱ中剂量组； D.重楼皂苷Ⅱ高剂量组；与对照组比较，***P＜0.001

2.4 重楼皂苷Ⅱ对A549细胞活性氧含量的影响

与对照组比较，重楼皂苷Ⅱ中、高剂量组A549细胞ROS含量明显增加，差异有统计学意义（＜0.01）。结果见图4。

注：A.对照组；B.重楼皂苷Ⅱ低剂量组；C.重楼皂苷Ⅱ中剂量组； D.重楼皂苷Ⅱ高剂量组；与对照组比较，**P＜0.01

2.5 重楼皂苷Ⅱ对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组比较，重楼皂苷Ⅱ低、中、高剂量组Bcl-2蛋白表达显著降低，重楼皂苷Ⅱ中、高剂量组Bax蛋白表达显著升高，重楼皂苷Ⅱ低、高剂量组cleaved Caspase-3蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。结果见表1、图5。

表1 各组A549细胞Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，*＜0.05，**＜0.01

注：A.对照组；B.重楼皂苷Ⅱ低剂量组；C.重楼皂苷Ⅱ中剂量组； D.重楼皂苷Ⅱ高剂量组

3 讨论

肺癌当前以手术、化疗和放疗为主，但不良反应大。天然植物类抗肿瘤药物因其不良反应少成为研究热点[7]。有研究显示，重楼皂苷Ⅱ对膀胱癌[8]、肝癌[9]等具有一定作用。本研究通过体外实验探讨重楼皂苷Ⅱ对人非小细胞肺癌A549细胞的作用及相关机制。

CCK-8实验结果显示，重楼皂苷Ⅱ可降低细胞存活率，提示重楼皂苷Ⅱ可抑制A549细胞增殖，且随着药物浓度增加，抑制效果增强。当线粒体产生能量时，线粒体内膜将质子泵入内膜和外膜之间的空隙，导致大量质子积聚，形成质子梯度，并在两侧产生电位差，从而形成MMP，MMP是评价线粒体功能完整性的指标[10-11]。采用荧光染料JC-10检测MMP，结果显示，重楼皂苷Ⅱ处理后，A549细胞MMP降低，提示呼吸链受损，线粒体功能异常。线粒体能吸收并释放Ca2+，从而维持细胞正常功能，如新陈代谢、增殖和凋亡等[12]。Ca2+水平升高导致线粒体Ca2+超负荷，使线粒体外膜通透性增加，线粒体内的Ca2+释放到细胞质中，诱导线粒体功能障碍[13]。重楼皂苷Ⅱ处理后，细胞内Ca2+水平升高，导致线粒体肿胀、破裂，进而诱导细胞凋亡。低浓度ROS在细胞生理调节中起重要作用，高浓度ROS可产生毒性作用导致细胞死亡[14]。线粒体是产生ROS的主要场所，ROS水平升高可使线粒体膜通透性增加，促进细胞色素C释放，并激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡[15-16]。采用DCFH-DA荧光染料检测细胞内ROS含量，结果显示，重楼皂苷Ⅱ可增加A549细胞内ROS含量，提示重楼皂苷Ⅱ可使线粒体发生氧化应激反应。

凋亡是细胞程序性死亡的主要方式，在维持组织稳态中起重要作用[17]。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡中起重要调节作用，主要由抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax等组成。凋亡系统激活后，Bax和Bcl-2会在线粒体外膜上形成同型低聚体，并使细胞色素C释放进入细胞质，诱导Caspase激活[18]。本研究结果表明，重楼皂苷Ⅱ处理后，A549细胞促凋亡蛋白Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达降低，提示重楼皂苷Ⅱ可促进细胞凋亡。

综上所述，重楼皂苷Ⅱ可诱导细胞凋亡，其作用机制可能与降低A549细胞MMP，提高细胞内Ca2+水平，增加细胞内ROS含量，调节Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表达有关。本研究为重楼皂苷Ⅱ用于NSCLC的辅助治疗提供了实验依据。

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Effects of Polyphyllin Ⅱ on Apoptosis of Human Non-Small Cell Lung Cancer A549 Cells

YOU Lijiao, SUN Fangyuan, YANG Xiaofang, GENG Huan, LEI Ming

To observe the effects of polyphyllin Ⅱ on human non-small cell lung cancer A549 cells; To explore its possible mechanism of action.Different concentrations of polyphyllin Ⅱ acted on A549 cells for 48 hours, and the cell survival rate was detected by CCK-8 method. A549 cells were divided into control group, polyphyllin Ⅱ low-, medium-, and high-dosage groups, and JC-10 fluorescent probe was used to detect MMP; Fluo-4 AM fluorescent probe was used to detect intracellular Ca2+level; DCFH-DA fluorescent probe was used to detect intracellular ROS level; Western blot was used to detect the protein expressions of Bax, Bcl-2, and cleaved Caspase-3 in cells.Compared with the control group, the survival rate of A549 cells in each polyphyllin Ⅱ group significantly decreased, with statistical significance (<0.01). The MMP of A549 cells was significantly reduced, the levels of Ca2+and ROS significantly increased, and the expression of Bcl-2 protein was significantly reduced in each polyphyllin Ⅱ group; protein expressions of Bax and cleaved Caspase-3 increased significantly in polyphyllin Ⅱ high-dosage group, with statistical significance (<0.05).Polyphyllin Ⅱ may promote A549 cell apoptosis by reducing cell MMP, increasing intracellular Ca2+level, increasing intracellular ROS content, and regulating apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax, cleaved Caspase-3 expression.

non-small cell lung cancer; polyphyllin Ⅱ; A549 cells; mitochondria; apoptosis

R285.5

A

1005-5304(2021)10-0081-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202103001

国家自然科学基金面上项目（81973649）；浦东新区卫生健康委员会领先人才培养项目（pwr12019-02）；浦东新区卫生健康委员会学科建设项目（PWZy2020-07）；浦东新区卫生健康委员会临床高原学科建设计划（PWYgy2018-01）

雷鸣，E-mail：leiming6891@163.com

（收稿日期：2021-03-01）

（修回日期：2021-03-20；编辑：郑宏）