表面活性剂胁迫培养对4株细菌生长的影响

李淑英，李 燕，胡贵莲，张翠萍，申太波，刘淑娟，周元清

(玉溪师范学院化学生物与环境学院， 云南 玉溪 653100)

0 引言

表面活性剂是一类加入微少量就能使表面张力减少的有机物，有杀菌、润滑等功能，被广泛应用到各个领域，大量使用时，会带来很多严重的环境问题，给生态环境带来较大影响[1]。表面活性剂对微生物的毒性，一方面是通过与细胞膜中的液态成分作用使细胞膜溶解，另一方面是通过与细胞中的重要功能蛋白发生反应[2]，表面活性剂的毒性与类型及表面活性剂浓度有关[3,4]。十二烷基硫酸钠(SDS)为白色或淡黄色粉状，有去污、乳化和优异的发泡力，是一种阴离子表面活性剂；聚乙二醇6000(PEG6000)为白色蜡状固体薄片或颗粒状粉末，属于非离子型表面活性剂[5]。表面活性剂在工业行业中应用较广泛，有杀菌与消毒作用，其主要原因是可以和细菌生物蛋白质发生作用，加速蛋白质分子变性[6]，所以微生物生长变化可以直接反映出水体受污染程度，将微生物作为表面活性剂毒性监测指示者具有一定的实用价值[7]。

本实验选择4株细菌作为研究对象。2株革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌和简单芽孢杆菌；2株革兰氏阴性菌：大肠杆菌和变形杆菌。用不同浓度的表面活性剂PEG6000、SDS胁迫培养后，对4株细菌测定生长曲线，分析不同浓度PEG6000、SDS对细菌生长的影响。结果发现：4株细菌对两种表面活性剂表现出不同的敏感性，两种表面活性剂对细菌的毒性也表现出较大差异，为表面活性剂污染环境后对细菌的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

枯草芽孢杆菌(BaciLLussubtiLis)，简单芽孢杆菌(BaciLLussimpLex)，革兰氏阳性菌(G+)；

大肠杆菌(EscherichiacoLi)，变形杆菌(ProteusvuLgaris)，革兰氏阴性菌(G-)。

1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨 10g；酵母膏5g；NaCl 10g；蒸馏水1000mL。

1.3 方案设计

1.3.1 菌种活化

将4株供试菌种在无菌条件下转接于LB培养基，连续转接2次，于35℃恒温培养24h后备用。

1.3.2 不同浓度表面活性剂培养基配制

250mL锥形瓶盛100mL LB液体培养基，加入PEG6000，浓度分别为：0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L，每个浓度3个平行；加入SDS，浓度分别为：0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L，每个浓度3个平行；同时设置对照。

1.3.3 胁迫培养

将活化后的斜面菌种用3mL无菌水洗脱3次，合并倒入无菌试管中混匀。

用10mL的移液管将胁迫培养基分别加入三角瓶中，每个三角瓶10mL，用牛皮纸包扎好置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌。灭菌后，分别按照浓度梯度为0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L添加PEG6000，0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L添加SDS，另以不含表面活性剂的培养基作对照，在无菌条件下将扩大培养的菌液按10%的接种量分别接种于上述培养基中，置于摇床(120r/min)上恒温(35℃)摇瓶培养。

1.3.4 生长曲线测定

培养过程(96h)中每隔8h无菌操作取样1次，于可见光分光光度计600nm处测其吸光度，每个样品有3个平行，求其平均值，绘制4种细菌在不同浓度PEG6000、SDS胁迫培养过程中的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 PEG6000 胁迫对4株细菌生长曲线的影响

由图1～图3可看出，PEG6000对枯草芽孢杆菌、简单芽孢杆菌和大肠杆菌的生长有影响，PEG6000浓度为0.5～2.0g/L时，对3株细菌的生长都表现为抑制作用；当PEG6000浓度为2.0g/L时，对大肠杆菌的抑制作用明显；简单芽孢杆菌则表现为PEG6000浓度为1.0g/L生长受到明显抑制。有研究[8]发现，低浓度表面活性剂(TCJ0.1g/L和KPS 0.2g/L)对细菌的生长表现为促进作用，高浓度(1.5g/L)表面活性剂对细菌表现出抑制作用，本实验中PEG6000对枯草芽孢杆菌、简单芽孢杆菌和大肠杆菌的生长都表现为抑制作用。聚乙二醇6000(PEG6000)是广泛选用的模拟干旱的渗透剂[9]，对细胞的生长发育有较大影响，PEG6000对枯草芽孢杆菌、简单芽孢杆菌和大肠杆菌的生长抑制作用较TCJ和KPS明显,本实验选择PEG6000浓度较高也会影响3株细菌的生长。

图1 PEG6000胁迫下枯草芽孢杆菌生长曲线

图2 PEG6000胁迫下简单芽孢杆菌生长曲线

图3 PEG6000胁迫下大肠杆菌生长曲线

由图4可看出，变形杆菌PEG6000胁迫培养有较强的耐受性和适应性，在96h内变形杆菌的生长表现出上升趋势，24h内变形杆菌的生长低于对照，说明一段时间内PEG6000对变形杆菌的生长有抑制作用，随着培养时间的延长，变形杆菌的生长逐渐升高，应该是大肠杆菌对PEG6000胁迫环境有较强的适应能力，过度地使用表面活性剂也可能使细菌产生耐药性[10]。

实验结果表明，在低浓度下，PEG6000对两种细菌的生长具有一定的刺激作用，在高浓度下，对枯草芽孢杆菌的生长具有抑制作用，但是抑制效果不太明显，对假单胞菌的生长还是表现为促进作用。说明PEG6000的毒性不是太强，对细菌生长的胁迫作用不太显著。且两种细菌对PEG6000的敏感程度不同，枯草芽孢杆菌(G+)比假单胞菌(G-)更敏感，可能原因是两种细菌的结构差异和对不良环境的适应能力不同[5]。

2.2 SDS胁迫培养对4株细菌生长曲线的影响

由图5～图8可看出，SDS对4株细菌的生长影响较大，本实验SDS>0.4g/L后对4株细菌的生长都表现为抑制作用，与雷鸣[11,12]等人研究结果类似，其结果表明表面活性剂质量浓度>0.5g/L时，微生物种群数量降低。SDS对纳豆芽胞杆菌的生长具有较大的影响，即使在0.2g/L的低浓度下也不能使菌体正常生长[13]，本实验中当SDS浓度为0.2g/L时，4株细菌在一段时间内生长明显受到抑制，后期对SDS表现出不同的适应能力：枯草芽孢杆菌40胁迫培养40h后开始有生长，大肠杆菌与变形杆菌胁迫培养56h后出现生长现象，而简单芽孢杆菌对SDS胁迫环境适应能力较弱，直至88h后才开始生长。4株细菌在初期培养过程中对一定浓度SDS(本实验为0.2g/L)耐受性较弱的菌群大量死亡，少量耐受性较强的菌群由于外界环境变化所造成的环境胁迫会诱惑其产生保护或适应机制来适应环境变化，从而使其生存能力提高，导致细菌数量大量增加[14]。枯草芽孢杆菌是用于研究芽孢萌发的模式微生物，对其芽孢萌发的特点及机制[15,16]较多，环境因素会影响芽孢萌发，同时芽孢在其他因子，如溶菌酶、盐、高压、2，6吡啶二羧酸钙(Ca+-DPA)以及阳离子表面活性剂作用下也能萌发。实验中选择的简单芽孢杆菌是从湿地植物-香蒲根际经过HCB多次胁迫培养筛选分离到的内生细菌，研究[17]发现该菌株芽孢形成时间较早，基础培养基上培养16h即出现芽孢，这一特征有别于其他芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌为46h)。其他生物学特性还在进一步研究中，芽孢萌发“多信使，多受体”假说认为超表达芽孢的萌发受体能增加萌发速率，而低表达则会出现深度休眠芽孢[18]，简单芽孢杆菌在胁迫环境中是否产生了深度休眠芽孢导致其在SDS(0.2g/L)环境中芽孢的萌发延迟还需深入研究，该菌株在本实验中芽孢萌发时间为80h。

图5 SDS胁迫下枯草芽孢杆菌生长曲线

图6 SDS胁迫下简单芽孢杆菌生长曲线

图7 SDS胁迫下大肠杆菌生长曲线

图8 SDS胁迫下变形杆菌生长曲线

实验结果表明，SDS在低浓度下(本实验为0.2g/L)对4种细菌的生长前期有明显的抑制作用，说明SDS的毒性比PEG6000更强，SDS浓度为0.4g/L时，4株细菌的生长已经完全被抑制。研究[19,20]认为两类细菌对外界污染的敏感程度不同，G+比G-更敏感，原因是两类细菌结构及成分有差异，导致其解毒抗性能力不同，对不良环境的适应能力也不同。

3 结论

3.1 4株细菌对两种表面活性剂的敏感性不同

PEG6000(浓度：0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L)和SDS(浓度：0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L)对简单芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及大肠杆菌都有抑制作用，其中PEG6000有抑制现象但3株细菌还有生长，SDS浓度>0.4g/L 3株细菌的生长完全停止，SDS浓度为0.2g/L时培养一段时间3株细菌数量开始增加，应该是遗传变异所致；变形杆菌对PEG6000和SDS表现有差异，该实验浓度条件下PEG6000促进变形杆菌的生长，变形杆菌在SDS(0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L)条件下生长完全被抑制，试验发现4种细菌在PEG6000和SDS的胁迫作用下，G+比G-更敏感。

3.2 不同的表面活性剂对微生物的毒性有明显差异

实验通过测定阴离子表面活性剂(SDS)和非离子表面活性剂PEG6000对4株细菌胁迫后生长曲线的变化后发现，低浓度(0.2g/L))的SDS对细菌的生长表现出明显的抑制作用，当SDS浓度>0.4g/L后对4株细菌的生长完全抑制；相对高浓度(2.0g/L)的PEG6000对细菌生长也有抑制作用，变形杆菌在此浓度下表现为促进作用，两种表面活性剂对4种细菌的毒性顺序为SDS>PEG6000。