HPLC波长切换法测定金刚藤及其制剂中落新妇苷等5种成分的含量

陈卫平，陈 梦，纪晓燕，卢光英，毛菊华，王伟影*

（1.丽水市质量检验检测研究院，浙江丽水 323000；2.浙江维康药业股份有限公司，浙江丽水 323000）

金刚藤（菝葜）为百合科植物菝葜（Smilax china L.）的干燥根茎，具有利湿去浊、祛风除痹、解毒散瘀的功效，用于治疗小便淋浊、带下量多、风湿痹痛、疔疮痈肿[1]；以金刚藤独一味药材提取物制成的制剂金刚藤胶囊和金刚藤软胶囊，具有清热解毒、化湿消肿的功效，用于附件炎等妇科疾病的治疗[2-3]。金刚藤药材现行标准缺少指标性成分含量测定[1]，其独一味制剂选用的指标性成分为薯蓣皂苷元，含量测定方法存在前处理烦琐、干扰组分较多等缺点[2-3]。为更好地控制金刚藤及其独一味制剂的质量，本试验在相关质控方法研究和药理活性研究的基础上[4-12]，选取了落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸、白藜芦醇和山柰素等5个活性、指标性成分，采用HPLC波长切换法测定其在金刚藤药材和制剂中的含量，以期为金刚藤药材及其独一味制剂的质量评价和质量控制提供一种普适方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；G4212B二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）；电子天平（XPE105，瑞士梅特勒公司）；水浴锅（KQ-250DE，昆山市超声仪器有限公司）；超纯水仪（DIRECT 8/16，美国密理博公司）。

1.2 试剂

落新妇苷对照品（上海安谱实验科技股份有限公司，批号：V7840010，质量分数：99.8%）；原儿茶酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110809-200604，质量分数：100.0%）；绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110753-201817，质量分数：96.8%）；白藜芦醇对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110535-200301，质量分数：100.0%）；山柰素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110861-201209，质量分数：93.2%）；甲醇为色谱纯（Merck）；乙腈为色谱纯（Merck）；磷酸为色谱纯（科密欧）；乙醇为分析纯（杭州高晶精细化工有限公司）；水为自制纯化水。

1.3 药材及制剂

金刚藤药材经丽水市食品药品与质量技术检验检测院副主任中药师王伟影鉴定，为百合科植物菝葜（Smilax china L.）的干燥根茎。金刚藤药材及独一味制剂均为市场购入（详见表1）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱温为30℃；流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，乙腈10%→15%；10～20 min，乙腈15%→25%；20～28 min，乙腈25%→30%；28～35 min，乙腈30%→40%；35～40 min，乙腈40%→50%；40～45 min，乙腈50%→70%；45～50 min，乙腈70%），流速为1.0 mL·min-1；柱温35℃；检测波长0～33 min为306 nm，33～50 min为365 nm；进样量：10μL，理论板数按落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸、白藜芦醇与山柰素计均不低于5000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸、白藜芦醇和山柰素对照品适量，分别加甲醇制成每1mL含落新妇苷543.41μg、原儿茶酸223.00μg、绿原酸573.06μg、白藜芦醇218.60μg和山柰素201.00μg的溶液，作为储备液。精密吸取5种储备液置同一量瓶中，加甲醇制成每1mL分别含落新妇苷54.341μg、原儿茶酸22.300μg、绿原酸57.306μg、白藜芦醇21.860μg和山柰素10.553μg的混合溶液，作为混合对照品溶液（已按各自质量分数折算）。

2.3 供试品溶液的制备

金刚藤供试品溶液的制备：称取样品粉末（过三号筛）2.0 g，精密称定，加入70%乙醇100 mL，加热回流提取1 h，取出放冷至室温，以70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

金刚藤制剂的制备：称取样品内容物2.0 g，精密称定，加入70%乙醇100 mL，加热回流提取1 h，取出放冷至室温，以70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.4 系统适用性试验

分别精密吸取“2.2、2.3”项下溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图1。在该色谱条件下，落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸、白藜芦醇和山柰素与其他成分均可达到基线分离，理论塔板数均在8000以上，分离效果较好。

图1 高效液相色谱图

2.5 线性关系、检出限和定量限考察

精密吸取混合对照品溶液1、2、5、8、10μL，分别进样测定，按2.1项下色谱条件进行测定，以峰面积（Y）对进样质量（X，ng）进行线性回归；以信噪比为3时的质量为检出限，信噪比为10时的质量为定量限，结果详见表2。

表2 化合物的回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限

2.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸、白藜芦醇和山柰素峰面积的RSD分别为0.77%、1.62%、0.65%、0.83%、1.55%，结果显示仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取金刚藤软胶囊，平行取样6份，照“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定，按干燥品计算供试品中落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸、白藜芦醇和山柰素的含量分别为0.250 mg·g-1、0.196 mg·g-1、1.296 mg·g-1、0.101 mg·g-1、0.029 mg·g-1，RSD分别为1.13%、1.26%、0.89%、1.06%、1.32%。

2.8 稳定性试验

取“2.3”项下供试品溶液，分别在0、6、12、18、24、36 h进样，结果落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸、白藜芦醇和山柰素峰面积的RSD分别为1.19%、1.35%、0.97%、1.08%、1.46%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的金刚藤软胶囊6份，各约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸、白藜芦醇和山柰素对照品储备液溶液1.0 mL、1.8 mL、4.5 mL、1.0 mL、0.3 mL及70%乙醇91.4 mL，按“2.3”项下方法制备回收率试液，按“2.1”色谱条件测定，测定落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸、白藜芦醇和山柰素的含量，计算得回收率分别为100.02%、99.01%、100.16%、100.26%、99.56%，RSD分别为1.57%、1.06%、1.292%、1.12%、1.67%。

2.10 样品含量测定结果

取各样品约2.0 g，各3份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 金刚藤及其制剂中各成分的含量测定结果（mg·g-1，n=3）

3 讨论

在参考相关研究的基础上[8-12]，考察了甲醇-水和乙腈-水两个系统，结果以乙腈-水系统加入少量磷酸分离效果较理想且峰形较佳、分析时间短。本文在预实验时选用4波长（260 nm、290 nm、330 nm和365 nm）同时测定5种成分，结合190～400 nm波段紫外扫描的结果，确定306 nm作为落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸和白藜芦醇的检测波长，365 nm作为山柰素的检测波长，并选择33 min为波长切换点，检测波长由306 nm变成365 nm，使落新妇苷、原儿茶酸、绿原酸、白藜芦醇和山柰素可以在同一色谱条件下测定，且色谱峰可以在同一色谱图中呈现。此法不仅适用于DAD检测器、双波长紫外检测器，也适用于普通的单波长紫外检测器，具有普适性、便捷等优点，可为金刚藤及其独一味制剂质量评价提供方法参考。

测定结果显示：不同产地和不同企业的金刚藤独一味制剂中5种成分含量差异较大；绿原酸为其中最稳定、含量优势明显的成分；山柰素在3个金刚藤药材中均不能检出，在2个独一味制剂中均有检出，含量差别近4倍；落新妇苷、原儿茶酸和白藜芦醇在不同产地的金刚藤中差别较大，在两个独一味制剂中差别亦较大。各成分差异大，初步判断可能与产地、采收时间有关，项目组在后续研究中将针对金刚藤产地和采收时间进行研究。鉴于化合物的特征性和药效活性，结合相关研究[8-12]，建议将落新妇苷、白藜芦醇和绿原酸3种成分作为金刚藤及其独一味质量评价的指标成分。