NaHCO3碱度胁迫对大鳞鲃氧化应激水平的影响❋

张宇婷， 杨 建， 耿龙武， 王 雨，姜海峰，李晨宇，徐 伟❋❋

(1. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所， 黑龙江 哈尔滨 150070；2. 黑龙江省冷水性鱼类种质资源及增养殖重点开放实验室, 黑龙江 哈尔滨 150070；3. 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心， 上海 201306)

我国有大量的盐碱水资源，尤其是东北地区水体碱度高、硬度大[1]。研究发现，高盐碱胁迫会导致鱼类产生应激反应[2]，而鱼类在应激状态下，其机内会产生大量的有害的氧自由基或者磷酸化的产物，从而对鱼体产生危害[3-5]。为了协调机体应对环境中的盐碱胁迫，鱼体重新进行能量分配和生理调节，不可避免的削弱鱼类的生长、繁殖和免疫等机能，严重甚至造成鱼类的死亡[6-7]。研究表明，不同鱼类在盐碱胁迫下的免疫应激反应和调控机制不尽相同[8-9]。因此，掌握不同养殖对象在盐碱胁迫下生理生化变化和应激反应机制，可为盐碱水体中的养殖与生产提供一定的理论基础。

大鳞鲃(Luciobarbuscapito)原产于乌兹别克斯坦，具有耐盐碱、抗逆性强以及生长速度快等特点[10-12]。目前，有关大鳞鲃的碱度适应性研究主要集中在生存[12]、生长发育[11]、渗透调控[2]等方面，而在氧化应激响应方面，本实验室前期仅针对NaHCO3碱度胁迫下大鳞鲃肝、肾和鳃组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等的活性变化进行了初步分析[8]，为了更全面地揭示碱度胁迫对大鳞鲃机体氧化应激水平的影响，本研究检测分析了不同碱度胁迫下，大鳞鲃肝、肾和鳃组织中酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)等氧化应激参数、血清皮质醇和促肾上腺皮质激素水平以及组织结构的变化，以期阐明碱度胁迫对大鳞鲃抗氧化能力和机体应激水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验鱼取自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰试验站。随机挑选300尾体长(28.7±1.0) cm，体质量(246.00±7.56) g的健康、体型正常1龄幼鱼于室内暂养3 d。其中，实验鱼的雌雄比例为1∶1。暂养用水为曝气2 d的自来水，水温23 ℃。

根据杨建等[8]的报道和预实验结果，设置4个NaHCO3碱度实验组(10.0、20.0、30.0和40.0 mmol/L)和淡水对照组实验组(0.5 mmol/L)，pH分别为8.28、8.43、8.55、8.63和8.05。每组设置3个平行，每个平行组随机放鱼30尾，各实验组3个平行共用一个循环缸。实验溶液采用曝气2 d的自来水和NaHCO3(国产，分析纯)在体积202 L的玻璃缸中进行配制[13]，并用酸碱滴定法检测校准，稳定2 d后放鱼，开始为期7 d的胁迫实验，期间每天换1/3溶液。为减小鱼体在打捞过程中产生的应激反应，实验期间每天投喂1次，水温为(22.0±1.5) ℃。

1.2 试验方法与样品采集

实验开始后分别于3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h和7 d共 7个时间点进行样品采集。用40 mg/L的MS-222麻醉，各组在各时间点分别从3个平行组随机采集1尾实验鱼，共采集3尾。尾部静脉采集血液样本，4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min，取上清于-80 ℃保存待测；冰上解剖采集实验鱼肝、肾和鳃组织，并用4 ℃预冷的生理盐水润洗，用吸水纸吸干后迅速放入冻存管，液氮保存待测[13]。此外，取部分肝、肾和鳃组织用Bouin’s液固定，用于组织切片的制备与观察。

1.3 组织氧化应激指标和激素水平测定

取0.2 g肝、肾和鳃组织样本，按照质量与体积比1∶9加入预冷的0.86%生理盐水，用组织研磨仪(MM400，Retsch)10 000～15 000 r/min研磨成10%组织匀浆。将制备好的10%匀浆4 ℃条件下2 500 r/min离心10 min(sigma,德国，离心半径为13.5 cm)，取上清，用于测定ACP、AKP、GSH-Px和MDA，测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

采用酶联免疫法ELISA和Synergy HTX多功能检测仪(Bio Tek)测定大鳞鲃血清皮质醇和促肾上腺皮质激素，试剂盒购自上海酶联生物有限公司(Cat.# m1003467-C)。

1.4 石蜡切片制作

石蜡切片采用苏木精-伊红染色法(HE染色法)。将固定好的组织在乙醇中梯度脱水，经二甲苯透明后，将组织用石蜡包埋、在切片机上进行切片，切片厚度为5 μm。切片用苏木精溶液、酒精、伊红染料进行染色，染色后切片经酒精梯度脱水后再经二甲苯透明，最后用树胶封片。在光学显微镜(OLMPUS BX53，Japan)下拍照观察组织结构。

1.5 数据分析

实验结果均以Mean±SD表示，并运用SPSS 20.0与Graphpad prism 8软件单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验其显著性，采用Duncan’s多重比较分析各指标的差异(P<0.05.)。

2 结果与分析

2.1 NaHCO3碱度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织ACP活力的影响

如图1所示，相同碱度胁迫下，大鳞鲃肝和肾组织中ACP活力变化显著(P<0.05)，其均随胁迫时间的延长呈现出先上升后下降的变化趋势，鳃组织ACP活力则呈现先升后降并逐步趋于平稳的变化趋势；3种组织酶活力均在12 h时达到峰值。在胁迫前期，相同时间点，3种组织中ACP活力均随碱度的升高而显著升高(P<0.05)；随着胁迫时间的延长，各碱度实验组在胁迫7 d内，3种组织 ACP活力均恢复至对照组水平。此外，淡水对照组3种组织ACP活力在整个实验过程中无显著性差异(P>0.05)。在碱度胁迫下，肾组织ACP活力最高，为1.5～3.4 U/g；肝组织和鳃组织次之，分别为1.1～2.5 U/g和0.8～2.5 U/g。

(a、b、c分别表示大鳞鲃肝、肾、鳃组织的ACP活力。图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。a, b, and c represent the ACP activity of liver, kidney, and gill. Different low case letters indicate significant differences (P<0.05).)

2.2 NaHCO3碱度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织AKP活力的影响

由图2可知，相同碱度胁迫下，大鳞鲃肝、肾和鳃组织中AKP活力均随胁迫时间的延长呈现出先上升后下降的显著变化(P<0.05)，而肾和鳃组织AKP活力则在胁迫48 h后逐渐趋于稳定；3种组织AKP活力均在胁迫12 h时达到最大。碱度胁迫初期，相同时间点，3种组织中AKP活力均随着碱度的升高而显著升高(P<0.05)；且3种组织AKP活力均在胁迫7 d内基本恢复至对照组水平。此外，对照组3种组织AKP活力在整个实验过程无显著性差异(P>0.05)。在碱度胁迫下，肾组织AKP活力(0.9～1.6 U/g)最高，肝组织(0.2～1.7 U/g)次之，鳃组织(0.1～0.7 U/g)最小。

(a、b、c分别表示大鳞鲃肝、肾、鳃组织的AKP活力。图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。a, b, and c represent the AKP activity of liver, kidney, and gill. Different low case letters indicate significant differences (P<0.05).)

2.3 NaHCO3碱度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织GSH-Px活力的影响

由图3可知，相同碱度胁迫下，大鳞鲃肝、肾和鳃组织中GSH-Px活力变化显著(P<0.05)，其均随胁迫时间的延长呈现先上升后下降的变化趋势，且3种组织酶活力均在胁迫12 h时达到峰值。碱度胁迫初期，相同时间点，3种组织中GSH-Px活力均随着碱度的升高而显著升高(P<0.05)，且3种组织各碱度处理组均在胁迫7 d内恢复至对照组水平。此外，淡水对照组3种组织中GSH-Px活力在整个实验过程中无显著性变化(P>0.05)。在碱度胁迫下，肾组织GSH-Px活力(13.3～90.3 U/L)最高，肝组织(32.6～88.2 U/L)次之，鳃组织(22.9～60.8 U/L)最小。

(a、b、c分别表示大鳞鲃肝、肾、鳃组织的GSH-Px活力。图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。a, b, and c represent the GSH-Px activity of liver, kidney, and gill. Different low case letters indicate significant differences (P<0.05) .)

2.4 NaHCO3碱度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织MDA含量的影响

由图4可知，相同碱度胁迫下，大鳞鲃肝、肾和鳃组织中MDA含量均随胁迫时间的延长呈现先上升后下降的显著性变化(P<0.05)，3种组织均在胁迫12 h时MDA含量达到顶峰。碱度胁迫初期，相同时间点，3种组织中MDA含量均随着碱度的升高而显著升高(P<0.05)，3种组织均在胁迫7 d内基本恢复至对照组水平。在碱度胁迫下，肾组织MDA含量最高，为10.9～58.9 nmol/mg其次是肝组织和鳃组织，分别为3.9～58.6 nmol/mg和11.4～49.1 nmol/mg。

(a、b、c分别表示大鳞鲃肝、肾、鳃组织的MDA含量。图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。a, b, and c represent the MDA content of liver, kidney, and gill. Different low case letters indicate significant differences (P<0.05).)

2.5 NaHCO3碱度胁迫对大鳞鲃血清皮质醇激素和促肾上腺皮质激素水平的影响

由图5可知，相同碱度胁迫下，大鳞鲃血清皮质醇激素和促肾上腺皮质激素水平均随胁迫时间的延长而呈现先上升后下降的显著性变化(P<0.05)，且激素水平均在胁迫12 h时达到最高。此外，碱度胁迫初期，相同时间点，大鳞鲃血清中皮质醇激素和促肾上腺皮质激素的含量均随着碱度的升高而显著升高(P<0.05)，且随着胁迫时间的延长，2种激素水平均在胁迫7 d内恢复至对照组水平。碱度胁迫下，皮质醇激素和促肾上腺皮质激素的变化范围分别为46.0～209.0 ng/L和1.5～16.0 ng/L。

(图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different low case letters indicate significant differences (P<0.05).)

2.6 NaHCO3碱度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织结构的影响

观察发现，淡水对照组大鳞鲃肝细胞饱满，呈多面体，排列紧密(见图6a)；肾组织的结构完整，界限清晰，肾小管中细胞饱满且完整，第一近曲小管(PⅠ)管径较大，十分发达，管腔不规则，上皮细胞呈柱形，第二近曲小管(PⅡ)管径较小，管腔呈圆形，上皮细胞呈锥形(见图6c)；鳃组织鳃丝分布均匀，排列紧密，细胞饱满，胞间间隙不明显，鳃丝血管腔边界清晰，内有血细胞，鳃小片粗壮，间距较小，尖端膨大(见图6e)。

(图中a,c,e分别为7 d后对照组肝脏、肾脏和鳃组织；图中b,d,f分别为7 d后40 mmol/L碱度组肝脏、肾脏和鳃组织。 N：细胞核；LC：肝细胞；RC：红细胞；PⅠ：第一近曲小管；PⅡ：第二近曲小管；RT：肾小管；CC：泌氯细胞；SL：鳃小片。1：肝细胞萎缩；2：细胞核偏移；3：肾小管萎缩；4：鳃小片尖端收缩变小；5：鳃小片基部肿胀膨大。a, c and e showed the liver, kidney and gill tissues of the control group after 7 days, respectively；b, d, and f represent the liver, kidney and gill tissues of the 40mmol/L alkalinity group after 7 days, respectively N: cell nucleus; LC: liver cell; RC: red blood cell; PⅠ: first proximal; PⅡ: second proximal segment; RT: renal tubule; CC: chlorine cells; SL: gill lamellae.1: Hepatocyte atrophy; 2: Nuclear migration; 3: Renal tubules atrophy; 4: The tip of the gill lamella shrinks and becomes smaller; 5: Swelling and swelling of the base of the gill lamella.)

40 mmol/L NaHCO3碱度胁迫7 d后，肝细胞出现不同程度萎缩，且少量细胞出现细胞核偏移(见图6b)；肾组织中各级肾小管出现不同程度萎缩，肾小管外围出现大小不一，形状不规则的空白间隙(见图6d)；鳃组织中鳃丝细胞收缩，血管腔边界模糊，血细胞数量减少，鳃小片基部肿胀膨大，鳃小片尖端收缩变小(见图6f)。

3 讨论

3.1 NaHCO3碱度胁迫对大鳞鲃抗氧化水平的影响

研究发现，环境胁迫会引起鱼类机体应激反应，为维持内环境的稳态，机体各组织亦会产生相应的应激响应[14]。ACP和AKP是衡量机体免疫能力的重要指标[15]，通过催化机体生物活性物质的磷酸化和去磷酸化反应调控机体的新陈代谢；而GSH-Px是机体中用于清除过氧化物的一种酶，将过氧化物分解为水和氧气，从而保护机体免受过氧化物的损害[16]。本研究中，碱度胁迫初期，相同胁迫时间下大鳞鲃肝、肾和鳃组织中ACP、AKP和GSH-Px活力与碱度呈显著正相关性。说明大鳞鲃在进入碱度环境后，随着碱度浓度的升高，机体产生的应激响应强度随之增加，机体的ACP、AKP和GSH-Px水平亦升高从而应对环境对鱼体造成的应激损伤[13]。在高NaHCO3碱度环境下3种酶活力恢复稳定所需时间明显长于低碱度环境，这是由于高碱环境比低碱环境对机体产生的损伤更显著[8]，这与王卓等[17]、刘汝建等[18]的结果一致，与张宇婷等[13]在NaCl盐度环境对大鳞鲃胁迫的研究结果相似。此外，相同碱度条件下，不同组织ACP、AKP和GSH-Px活力大小亦不相同，其中肾组织3种酶的活力最大，肝次之，鳃组织最小；表明肾组织在应对NaHCO3碱度胁迫过程中发挥着至关重要的作用。

MDA是脂质过氧化的终产物之一，可以有效反映机体脂质的过氧化水平高低，是衡量机体氧化损伤水平的重要指标之一[19]。本研究发现，碱度胁迫初期，相同时间下，大鳞鲃肝、肾、鳃组织中MDA含量随NaHCO3碱度的升高而显著升高；这表明在NaHCO3碱度胁迫下，大鳞鲃体内产生大量脂质过氧化物并被分解生成大量的MDA，且碱度越高，机体中脂质过氧化现象越严重[13,20]。此外，高碱条件下，3种组织MDA含量恢复初始水平所需时间显著高于低碱环境，这与廖亚丽等[21]的结果一致。

3.2 NaHCO3碱度胁迫对大鳞鲃血清皮质醇和促肾上腺皮质激素水平的影响

皮质醇和促肾上腺皮质激素水平的高低是反映鱼类应激状态的重要指标[22]。在环境因子胁迫下，鱼类机体可通过其下丘脑-垂体-肾间腺轴(HPI)，释放促肾上腺皮质激素和皮质醇等激素，进而促进机体糖类、脂质和蛋白质的代谢和免疫水平等，以应对机体的应激反应。本研究显示，胁迫初期，在同一胁迫时间下，大鳞鲃机体血清中皮质醇和促肾上腺皮质激素的含量在高碱胁迫下(40和30 mmol/L)明显高于低碱度组(10和20 mmol/L)且随着碱度梯度的升高急剧上升；而随着胁迫时间的延长，皮质醇激素和促肾上腺皮质激素的浓度在7 d内均逐渐恢复至对照组水平，表明大鳞鲃在碱度环境中通过机体自身的调控，逐步适应了碱度环境，这与Albert等[23]对盐度胁迫下花鳗鲡(Anguillamarmorata)的结论一致。

3.3 NaHCO3碱度胁迫对大鳞鲃组织结构的影响

环境胁迫下，鱼类机体除产生相应的生理生化变化外，机体某些组织的结构亦会发生适应性变化[24]。研究表明，NaHCO3碱度会对鱼类肝组织造成组织学病变[25]。本研究显示，在NaHCO3碱度胁迫下，大鳞鲃肝细胞出现轻微萎缩并伴有细胞核偏移等病理性变化，但实验期间并未出现细胞坏死现象。

肾脏是鱼类重要的渗透调控器官，在维持机体内环境稳定过程中发挥着重要作用[26]。淡水鱼类的肾组织的结构完整，界限清晰，肾小管中细胞饱满且完整；而海水鱼类的肾脏退化，肾小球变小，肾小管缩短；这一差异主要是由外界环境的渗透压差异所导致的。本研究亦发现，40 mmol/L高NaHCO3碱度胁迫下，大鳞鲃肾组织各级肾小管均出现不同程度萎缩，这与杨建等[27]的结果相一致。

鳃是鱼类与其生存环境直接接触的器官，易于受到环境因子的干扰而影响其正常的生理功能。本研究表明，在高碱度(40 mmol/L)胁迫下，大鳞鲃鳃丝细胞收缩，鳃小片基部肿胀膨大，鳃小片尖端收缩变小，比表面积增大，在一定程度上增加了水体与鳃丝的接触面积，有利于鳃组织与外界环境的离子交换和溶氧的获取[27]。随着环境碱度的进一步升高，鳃小片进一步萎缩，鳃上皮细胞坏死和脱落，鳃小片比表面积减小，生理机能亦受到影响，进而导致机体的死亡[25,27]。

在本研究中，大鳞鲃的肝、肾和鳃组织在40 mmol/L NaHCO3碱度胁迫下虽发生了病理性变化，但并未出现病理性表现或者死亡现象。由于本实验为短期胁迫试验，大鳞鲃的组织结构是否为适应性变化还需进行长期胁迫实验进行进一步的验证。

4 结语

在大鳞鲃刚进入碱度环境时，对外界环境产生了剧烈的反应，在曝露12 h内机体抗氧化能力逐步达到最强，之后随着时间的延长，逐步适应相应的碱度环境，7 d内各指标均基本稳定，整个实验过程中未出现死亡现象，表明大鳞鲃在高碱度(40 mmol/L) NaHCO3环境表现出较强的适应能力。