G蛋白信号转导调节因子19在结肠癌中的表达及临床意义*

谢平凡,谭 林,周红兵,陈维顺

中南大学湘雅医学院附属株洲医院消化内科，湖南株洲 412000

结肠癌是全球常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位居所有肿瘤的第二位[1]。结肠癌患者早期临床症状不明显，大多数患者确诊时已是中晚期，已错过早期诊断及治疗的最佳时机。准确的早期诊断是治疗结肠癌的关键。G蛋白信号调节蛋白(RGS)家族是一类能负性调节G蛋白活性的多功能蛋白。RGS19，是第一个被发现的RGS家族成员，参与调节G蛋白偶联受体(GPCR)下游细胞信号活动并与细胞增殖和生长密切相关[2]。RGS19蛋白的转录水平改变与多种癌症的发生和发展有关。在卵巢癌[2]、胃癌[3]、前列腺癌[4]等癌细胞中均发现RGS19表达上调，进而促进癌细胞增殖。目前，RGS19在结肠癌中表达情况和作用的相关报道甚少。为了明确RGS19在结肠癌中的表达水平及其临床意义，本文比较了RGS19在结肠癌组织和癌旁组织中的表达，并进一步分析了RGS19在结肠癌中的表达与临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院2014年5月至2015年7月结肠癌根治手术切除的100例结肠癌及30例癌旁组织标本。癌旁组织距癌组织边缘>15 cm，病理证实无癌浸润。所有标本来源的病例均经病理学诊断为原发性腺癌，且术前均未接受放化疗及相关靶向药物治疗。根据美国联合癌症委员会第八版TNM分类[5]对这些病例进行TNM分期，根据病理标准确认分化程度(高、中、低)。本研究组织标本的获取及使用均经本院伦理委员会批准，所有患者对本研究均知情。通过电话对所有患者进行随访，以手术日期为起始时间，以死亡为终点时间，随访截止时间为2020年7月。共随访100例，失访0例。

1.2方法

1.2.1免疫组化染色 结肠癌组织及癌旁组织经石蜡包埋处理后，切片为4 μm厚度。切片经二甲苯脱蜡处理，梯度乙醇(100.0%、85.0%、75.0%、50.0%乙醇)及双蒸水浸泡水化处理。用3.0%过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。水浴锅加热枸橼酸钠缓冲液(0.01 mol/L，pH 6.0)至90 ℃恒温，浸入切片继续加热15～30 min进行抗原修复，随后自然冷却。切片经PBS清洗后用10.0%兔血清37 ℃封闭10～15 min。弃去封闭液，加入RGS19一抗(稀释比例1∶1 200)，4 ℃孵育过夜。次日将切片用PBS清洗后滴加生物素标记的二抗工作液，37 ℃孵育20 min；PBS清洗，切片滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37 ℃孵育20 min。PBS洗涤后进行DAB显色反应，以及苏木精复染细胞核。脱水和封片后置于显微镜下观察，每个切片中随机选择5个视野进行结果统计。

1.2.2结果判断 RGS19的免疫组织化学结果由两位独立研究人员进行评估。RGS19染色定位于细胞核内。按阳性细胞百分比计分：0.0%～5.0%为0分，>5.0%～25.0%为1分，>25.0%～50.0%为2分，>50.0%～75.0%为3分，>75.0%～100.0%为4分；按染色强度计分：无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分。根据上述两项得分的乘积来划分低表达组和高表达组：<6分为低表达，≥6分为高表达。

1.3统计学处理 采用SPSS26.0软件进行统计学分析，计量资料用n表示，采用χ2检验分析RGS19在结肠癌及癌旁组织中的表达差异及与临床病理参数的关系；生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线分析法，并用Log-rank检验其统计意义；Cox回归模型分析结肠癌预后影响因素。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1RGS19在结肠癌组织中表达较癌旁组织高 免疫组化结果显示RGS19蛋白阳性染色定位于细胞核内。统计结果显示在30例癌旁组织中，RGS19的高表达率为33.3%；而在100例结肠癌组织中，RGS19的高表达率为61.0%，高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1和图1。

注：A为癌旁组织低表达；B为结肠癌组织低表达；C为结肠癌组织高表达。

表1 RGS19在结肠癌组织和癌旁组织中的表达[n(%)]

2.2RGS19的表达与临床病理特征的关系 RGS19在结肠癌组织中的表达与患者N分期、M分期和TNM分期有关(P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度和T分期无关(P>0.05)，见表2。

表2 结肠癌中RGS19的表达与临床病理特征的关系(n)

2.3RGS19高表达和低表达结肠癌患者5年生存分析 对本研究100例结肠癌患者随访5年，Kaplan-Meier生存曲线分析显示，RGS19低表达的患者中位生存时间为52个月，高于RGS19高表达患者的38个月，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3；RGS19低表达的患者总生存率(76.9%)高于RGS19高表达患者总生存率(44.3%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

表3 RGS19表达与结肠癌患者5年生存时间的关系

图2 RGS19高表达和低表达结肠癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.4结肠癌患者预后的影响因素分析 单因素Cox回归分析显示结肠癌RGS19的表达与TNM分期、T分期、N分期一样，都是影响结肠癌患者预后的因素；多因素Cox回归分析显示RGS19表达水平和TNM分期是影响结肠癌患者预后的独立因素(P<0.05)，见表4。

表4 影响结肠癌患者预后的单因素及多因素分析

3 讨 论

结肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤。随着结肠癌筛查的广泛开展，作为筛查目标人群的老年人中结肠癌的死亡率有所下降，但50岁以下的人群中结肠癌的发病率和死亡率却一直在增加[6]。结肠癌的诊断主要依靠临床表现和辅助检查。早期结肠癌患者症状不明显或轻微，是导致结肠癌不能被早发现和早治疗的主要原因。本研究通过检测结肠癌和癌旁组织RGS19的表达，并分析其与结肠癌患者临床病理特征和预后的关系，旨在为结肠癌诊断提供新的肿瘤标志物。

GPCR介导的信号传导通路在调节细胞稳态及应激响应中起着重要作用[7]。GPCR通过与G蛋白偶联来调节细胞内相关酶活性，产生第二信使作用于下游效应蛋白，从而将配体信号由细胞外传递至细胞内，改变细胞功能活性。G蛋白由α、β和γ 3个亚基组成。Gα亚基与GDP结合，以无活性状态存在；当GPCR与配体结合而激活后，Gα与β和γ亚基解离，并与GDP分离而与GTP结合。与GTP结合的Gα亚基处于活性状态，参与下游信号传导途径。RGS是一类GTP酶激活蛋白，可激活Gα亚基内在的GTP酶，使得与Gα亚基结合的GTP水解为GDP，使Gα亚基失活，从而负调节GPCR介导的信号通路[7]。RGS家族蛋白拥有130个氨基酸的保守结构域及结合激活的Gα亚基[8]。迄今为止，有研究发现RGS蛋白调节G蛋白信号转导通路参与多种细胞生物过程，包括细胞增殖、分化、质膜运输、细胞运动和胚胎发育等[9]。目前RGS家族已被发现有20多位成员[10]，其中至少有14种RGS蛋白被证明参与多种癌症的发生和发展进程[11]，其中研究较多的是RGS17、RGS20。RGS19在肿瘤中的作用也广泛受到关注，但目前相关研究结论不一。SAKAGUCHI等[12]通过GEO数据库、Oncomine数据库和TCGA数据库分析了RGS19在不同肿瘤和正常组织中的基因和蛋白表达水平，结果显示RGS19在膀胱癌、乳腺癌和肾癌组织中的表达均高于正常组织[3]。同样在其他临床研究中发现卵巢癌[2]、胃癌[3]、胰腺癌[13]、肺癌[14]中均有RGS19蛋白表达增加。然而，另外一些研究报道RGS19在白血病、肺癌和淋巴瘤中的表达低于正常组织[3]。在本研究中，RGS19在结肠癌组织中的高表达率(61.0%)明显高于癌旁组织(33.3%)，这与肺癌[13]、卵巢癌[15]中的研究结论一致。研究发现在小鼠F9畸胎瘤细胞中，低表达的RGS19会抑制Wnt/β-catenin信号传导[16]。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与结肠癌肿瘤细胞的过度增殖和恶变有关,参与结/直肠癌的发生；而阻断Wnt/β-catenin通路可抑制肿瘤的生长[17]。另外，JI等[18]研究发现上调RGS19可增加畸胎瘤细胞Akt的磷酸化水平，上调细胞周期蛋白D1/3，从而促进肿瘤细胞增殖。这些研究提示，RGS19能通过多重机制调控肿瘤细胞的增殖，参与肿瘤的发生和发展[2]。

在本研究中，RGS19高表达的结肠癌患者与RGS19低表达的患者相比，总生存时间明显缩短，总生存率降低。RGS19表达是结肠癌患者预后不良的独立危险因素。SAKAGUCHI等[12]在关于舒尼替尼耐药的肾透明细胞癌的研究中也有相似的发现，即RGS19高表达患者的总生存时间及无复发生存时间均低于低表达患者，并通过Cox分析发现RGS19是肾透明细胞癌的独立危险因子。众所周知，影响结肠癌预后的因素包括肿瘤的快速增殖和肿瘤的侵袭、转移。本研究结果显示结肠癌中高表达RGS19与淋巴结转移、远处转移和TNM分期有关，RGS19高表达者远处转移早，生存时间短，预后差。因此，检测RGS19的表达水平对判定结肠癌的侵袭转移与预后有一定临床价值。RGS19促进肿瘤侵袭转移的机制尚未明确。WANG等[19]研究发现，RGS19能结合GIPC蛋白，激活PI3K/Akt通路。该通路是介导细胞增殖、存活和迁移的常见信号通路；同时Akt磷酸化使MDM2从细胞质转移到细胞核，可使p53核失活，可进一步增强肿瘤细胞的侵袭转移能力[20]。本研究推测在结肠癌中RGS19可能有相似的作用机制。以上研究提示，RGS19在结肠癌中上调可能参与了结肠癌的发生和转移，可成为结肠癌预后判定的潜在指标，有必要就其具体机制，从分子水平、细胞水平和临床水平进行多层面的研究。

综上所述，RGS19在结肠癌患者中呈高表达，是影响患者预后的独立因素，可作为结肠癌诊断、预后判断的标志物以及治疗的新靶点[20]。