重症肺炎患儿支气管肺泡灌洗液中肝素结合蛋白和Th1/Th2型细胞因子的变化及临床意义*

梁 璐，刘艺清，渠 巍，陈 敏，胡 雷，宋晓梅

贵州省贵阳市妇幼保健院检验科，贵州贵阳 550003

近年来肺炎已成为威胁全世界儿童健康的最常见疾病，该病进展快且预后差，即使应用有效的抗感染和生命支持治疗，死亡率仍然居高不下[1-4]。肺炎的发展除了与病原体的毒力及侵袭性相关外，与机体的免疫功能失衡亦密切相关[5]。正常情况下，机体内的辅助性T淋巴细胞1(Th1)/Th2型细胞处于动态平衡，Th1/Th2型细胞的失衡与多种疾病的发生、发展和预后存在密切的关系[6-7]。

Th1细胞主要分泌白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等[8]；其中，外源性IL-4可促使CD4+CD45RO+前体细胞向Th2效应细胞分化，IFN-γ则抑制前体细胞向Th2细胞分化[9]，IL-4和IFN-γ在决定CD4+CD45R0+前体细胞向Th1或Th2分化过程中起重要的调节作用。

肝素结合蛋白(HBP)目前已被证实是一种能诱导血管渗漏和激活炎性反应的多功能介质[10]。急性呼吸窘迫综合征、创伤后呼吸障碍、败血症等患者的血浆中HBP水平会显著升高[11-12]，HBP水平的高低与疾病的严重程度和患者死亡率相关[13-14]。但目前关于HBP与小儿肺炎的相关性研究较少，且国内外大部分研究通常集中于患者的血液或脑脊液样本，鲜有研究调查肺炎患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中HBP表达水平的报道。与血液样本相比，BALF直接采集于患儿的支气管和肺泡病变部位，可更准确地反映病情。因此，本研究检测肺炎患儿BALF中Th1/Th2型细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6及HBP的表达水平和计算IFN-γ/IL-4比值，以分析这些指标与疾病严重程度的相关性和评估患儿的免疫状态，为临床及时评估病情、判断预后及免疫治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究选取2018年1月至2020年6月在本院就诊的90例肺炎患儿为肺炎组，其中男45例，女45例,平均(4.8±0.7)岁。根据《儿童社区获得性肺炎管理指南(2013修订)》标准将患者分为轻中度(n=49)和重度肺炎组(n=41)。另外，选取同期30例到本院取支气管异物但无肺部炎症的患儿作为对照组，其中男12例，女18例，平均年龄(3.9±1.4)岁。排除标准：血液疾病、中枢神经系统疾病、结核病和免疫缺陷等基础疾病患者。本研究已获得本院伦理委员会讨论通过。所有样本均经家庭成员确认并签署了同意书。

1.2仪器与试剂 HBP 测定试剂盒(免疫荧光干式定量法)[购自中翰盛泰生物科技公司(型号：FFHBP500,批号：HBP19S1A02F)]、干式荧光免疫分析仪(FIC-S100)[购自中翰盛泰生物科技公司(批号：FIL-S1001)]、细胞因子检测试剂盒[购自瑞斯凯尔生物科技公司(型号：R501001、R501002、R501003、R501007，批号：191005)]、流式细胞仪(购自BD公司FACSCantoⅡ)、台式离心机(购自长沙迈佳森仪器设备公司)。

1.3方法

1.3.1BALF的提取 两组患儿均行胸部CT和支气管镜检查。将支气管镜插入肺部病变区，使用注射器缓慢泵送5 mL 37 ℃预热盐水，并于采样点缓慢冲洗2～3次；然后将BALF通过无菌过滤器后收集。所有BALF样本在4 ℃下以1 500 r/min的速度离心后将上清液转至新EP管中，并于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.3.2HBP的检测 首先使样本在冰上完全解冻，然后将50 μL样本与150 μL缓冲液充分混匀，吸取100 μL混合液加入到试剂板的加样孔，孵育18 min，最后可直接在Jet-iStar 3000仪器上判读结果。

1.3.3IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6水平的检测 采取免疫分析及流式细胞仪分析结合法检测BALF中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6的水平。具体步骤如下：首先将实验用试剂恢复至室温，分别配置基质B、校准品和洗涤缓冲液；将样本按实际情况进行适当稀释；其次于试管中分别加入25 μL校准品和样本，其中校准品管再加入25 μL基质B，样本管中加入25 μL实验缓冲液；向所有管中加入25 μL捕获微球抗体，震荡1 min使其充分混匀；然后，每管中各加入25 μL检测抗体，锡箔纸包被各管，室温避光震荡2 h；接着于每管中加入25 μL SA-PE，锡箔纸包被各管，室温避光震荡0.5 h；250 g 离心5 min，吸取上清液，弃去；向每管中加入200 μL洗涤缓冲液以重悬微球；同样，250 g 离心5 min，吸取上清液，弃去；然后向每管中加入150 μL洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，上机检测。最后根据标准曲线计算出各细胞因子的浓度。每个样本设置3个重复孔。

2 结 果

2.1Th1/Th2细胞因子的表达 与对照组相比，肺炎患儿的BALF中Th1/Th2型细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6的表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，重症肺炎组患儿较轻中度肺炎组患儿的BALF中IL-2[(6.12±2.08)pg/mLvs.(2.81±0.9)pg/mL]、IFN-γ[(27.26±13.26)pg/mLvs.(12.99±4.03)pg/mL]和IL-6[(43.32±25.16)pg/mLvs.(18.59±8.55)pg/mL]的表达水平升高，且差异有统计意义(P<0.05)；两组患儿BALF中IL-4的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：A为各组Th1型细胞因子的表达水平;B为各组Th2型细胞因子的表达水平；与对照组相比，*P<0.05；与对照组相比，**P<0.05。

2.2HBP的表达 干式荧光免疫分析仪结果显示，轻中症肺炎组和重症肺炎组BALF中的HBP的表达水平显著高对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

注：与对照组相比，*P<0.01。

2.3INF-γ/IL-4比值的比较 与对照组相比，肺炎组INF-γ/IL-4比值明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)见图3A；其中，重症肺炎组患儿的 INF-γ/IL-4比值较轻中度肺炎患儿降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3B。

注：A为对照组与肺炎组患儿BALF中INF-γ/IL-4比值的比较;B为轻中症肺炎组与重症肺炎组患儿BALF中INF-γ/IL-4比值的比较；与对照组相比，*P<0.01。

3 讨 论

尽管目前国内外正不断探索治疗肺炎的新型药物和抗菌药物，但重症小儿肺炎的发病率和迁移率仍在逐渐增加，抗菌药物对该病的治疗效果相对有限[15]。因此，寻找早期识别局部炎症应答特点和评估病情的指标对及时治疗重症肺炎有重要意义。本研究显示，与对照组相比，肺炎组的BALF中Th1/Th2型细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6及HBP的表达水平显著升高，且差异有统计学意义(P<0.05)；其中重症肺炎组患儿较轻中度肺炎组患儿BALF中IL-2[(6.12±2.08)pg/mLvs.(2.81±0.9)pg/mL]、IFN-γ[(27.26±13.26)pg/mLvs.(12.99±4.03)pg/mL]和IL-6[(43.32±25.16)pg/mLvs.(18.59±8.55)pg/mL]的表达水平升高，差异有统计意义(P<0.05)，表明可通过观察这些指标预判肺炎患儿病情及疾病进展程度。虽然本文在轻中度肺炎及重症肺炎患儿的BALF中未观察到IL-4的表达水平存在明显差异(P>0.05)，但发现肺炎组患儿较对照组患儿的INF-γ/IL-4比值呈不同程度地增高，差异有统计学意义(P<0.01)；其中重症肺炎组患儿的 INF-γ/IL-4比值较轻中度肺炎患儿升高程度降低，差异有统计学意义(P<0.01)。该结果表明不同程度的肺炎存在不同程度的Th1/Th2型细胞因子失衡，其中重症肺炎患儿主要存在以Th2型细胞因子为优势的Th1/Th2型细胞因子偏移的免疫功能紊乱。通过检测肺炎患儿BALF中IL-2、IFN-γ、IL-4 和IL-6及HBP的表达水平，能及时准确地评估患者机体免疫功能状态和疾病的严重程度，为临床预判病情和治疗提供参考。本研究仅比较不同程度的肺炎患儿与无炎症患儿BALF中的Th1/Th2型细胞因子和HBP水平的差异，尚未分析不同病原体感染患儿BALF中细胞因子和HBP水平差异及与患儿病情转归的相关性。本团队接下来将进一步展开研究，以期更全面、准确地探讨这些指标对不同类型肺炎严重程度、预后及转归的评估价值。

正常状态时，Th1/Th2型细胞因子处于动态平衡，共同维持机体的免疫稳态；其中，在决定CD4+CD45R0+前体细胞向Thl/Th2型细胞因子分化过程中，IL-4和IFN-γ起着重要的调节作用[9]。已有研究发现，Th1/Th2型细胞因子失衡是引起儿童呼吸道感染的重要因素之一，且检测Th1/Th2型细胞因子对病情有一定预测作用[16]。但目前关于肺部感染患者Th1/Th2型细胞因子的研究结果仍存在争议。CLUTTON 等[17]认为肺部感染腺病毒的患者血浆中IL-4、IL-6的表达增高，而IFN-γ的表达降低，提示Th2型细胞因子功能亢进，机体免疫功能受抑制，从而导致病情进展。而MALAIYAN等[18]却发现，支气管炎患者Th2型细胞因子功能受抑制，免疫系统出现以Th1型细胞因子及其细胞因子占优势的Th1/Th2型细胞因子偏移。本研究结果显示，重症肺炎患儿主要存在以Th2型细胞因子为优势的Th1/Th2型细胞因子偏移，该结果与CLUTTON 等[17]的试验结果相符。但不同类型的肺部感染可能存在不同程度和趋势的Th1/Th2失衡，不同类型肺炎患儿的免疫状态有待进一步确认。

研究发现，急性呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、败血症等患者的血浆中HBP水平较阴性患者存显著差异[11-12]，且其水平与疾病的严重程度及患者死亡率相关[13-14]。目前国内外大部分研究均集中于分析细菌性脑膜炎患者的脑脊液[19]或尿路感染患者的尿液样本[20]中HBP水平的变化，关于肺部感染患者BALF中HBP的表达研究仍然很少，本研究首次通过检测重症肺炎患儿BALF中HBP、Th1/Th2型细胞因子的表达水平和IFN-γ/IL-4的比值，以观察肺炎患儿体内辅助性T细胞亚群Th1、Th2细胞的变化特点和评估患儿的免疫功能状况，有助于积极预防肺炎患儿的病情进展，对临床降低患儿死亡率有一定的积极意义。