银杏叶提取物对急性脑梗死模型大鼠血脑屏障功能及PI3K/AKT信号通路的影响及作用机制

谢涛波 钟纯正 符尧天 王国卿 米东华

(1儋州市人民医院神经内科，海南 儋州 571799；2儋州市农垦医院神经内科；3儋州市人民医院精神病科；4首都医科大学附属北京天坛医院神经重症医学科)

急性脑梗死又称为缺血性脑卒中，是老年人及三高人群致残、致死的主要原因，不仅严重影响患者的身心健康，还给患者家庭及社会带来巨大的经济负担和医疗负担〔1〕。脑动脉狭窄或堵塞会引起局部血流减少或中断，导致脑组织缺血、缺氧而出现坏死，由于脑组织的耗氧量远高于其他组织，对于缺血缺氧特别敏感，脑功能也是最早受损〔2〕。尽管急性脑梗死的发病机制尚不清楚，但血脑屏障的破坏是脑梗死后脑水肿发生的重要病理基础〔3〕。

目前，临床脑缺血类疾病的治疗效果仍不理想，寻求新的治疗方法和策略迫在眉睫。银杏叶提取物是提取自银杏叶的活性成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗凋亡等生理功效〔4〕。Liu等〔5〕报道，银杏叶提取物结合双嘧达莫注射液可辅助治疗急性脑梗死。Wu等〔6〕研究指出，银杏叶提取物可降低急性脑梗死大鼠脑组织细胞的凋亡，而起到保护保组织的作用。但银杏叶提取物对急性脑梗死后血脑屏障的破坏是否有保护作用，未见有文献报道。为此，本研究构建急性脑梗死大鼠模型，观察银杏叶提取物对模型大鼠血脑屏障功能的影响及作用机制，旨在为银杏叶提取物的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 60只雄性、健康级SD大鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，动物许可证号SCXK(京)2019-0010；银杏叶提取物(德国威玛舒，注册证号H20170088，规格：40 mg×20片)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液、TUNEL染色试剂盒(武汉博士德生物公司)，蛋白一抗(美国Abcam)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白二抗、电化学发光(ECL)试剂(上海碧云天生物科技有限公司)，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海朕硕生物科技有限公司)。

1.2急性脑梗死模型的构建 大鼠禁食12 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，于颈部正中切口，暴露颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，于颈内动脉和颈外动脉交叉处剪一小口，插入肝素预处理尼龙线结扎，阻断动脉血液流动，消毒后逐层缝合，术后注意抗感染处理和保暖。当大鼠出现左侧肢疼痛回缩迟钝或消失、倒悬时左上肢向胸前屈曲、行走时身体向左侧倾倒或向左转圈等表现时，神经损伤评分≥2分可判断急性脑梗死大鼠模型复制成功〔7〕。

1.3分组与处理 取60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、银杏叶提取物组(低剂量组和高剂量组)，除假手术组外，其他组采用中动脉闭塞法复制急性脑梗死模型，假手术组仅钝性分离肌肉和血管，但不夹闭血管。银杏叶提取物组术后灌胃50 mg/kg、100 mg/kg的银杏叶提取物，1次/d，连续灌胃7 d，假手术组和模型组以等体积生理盐水替代。

1.4伊文思蓝检测血脑屏障通透性 给药结束后，尾静脉注射2%伊文思蓝，24 h后麻醉大鼠，打开胸腔暴露心脏，将针尖沿心轴方向插入左心室，可见血液回流时夹闭针尖破口，再剪开右心耳，用生理盐水(约10 ml)进行心脏灌流，当右心耳流出液体澄清时，取出脑组织称重，以1.5 ml/g脑组织制备脑组织匀浆(50%三氯乙酸溶液)，3 000 r/m离心20 min后，于620 nm处检测吸光度值。

1.5大鼠神经功能评价 记录大鼠神经功能缺失症状，参照Longa标准〔8〕进行评定，无神经损伤症状为0分，提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直为1分，提尾时病灶对侧前肢屈曲为2分，行走时轻度向瘫痪侧转圈为3分，行走时严重向瘫痪侧转圈为4分，不能自发行走且向对侧跌倒为5分。

1.6脑组织含水量的测定 处理结束后，断头取出脑组织称重(湿重)，置于120℃烤箱内，烘干后取出再次称重(干重)，脑组织含水量=(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100%。

1.7TTC染色法测定脑组织梗死体积 处理结束后，断头取出脑组织，制备为厚度2 mm的脑片，置于2% TTC溶液中，37℃下染色7 min，再将脑片固定于4%多聚甲醛中，拍照后经图像分析软件测定脑梗死面积，脑梗死体积=〔总梗死体积-(梗死侧半球体积-梗死对侧半球体积)〕/梗死对侧半球体积×100%。

1.8TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡 处理结束后，断头取出脑组织，制备为厚度8 μm石蜡切片，水化处理后滴加不含DNA酶的蛋白酶K，室温下反应30 min，再添加3%过氧化氢溶液，室温下反应10 min，接着添加50 μl生物素标记物，37℃下反应60 min，再滴加100 μl终止液，室温下反应10 min，然后添加50 μl Streptavidin-HRP工作液，室温下反应30 min，最后进行二胺基联苯胺(DAB)显色、苏木素复染，经脱水、透明后封片。

1.9蛋白质印迹检测相关蛋白表达 处理结束后，断头取出脑组织，加入组织裂解液，冰上匀浆，充分裂解1 h，经12 000 r/m离心10 min，分离上清液检测蛋白浓度，取50 μg蛋白用于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白条带完全分离后电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，再将蛋白膜置于5%脱脂奶粉中，室温下孵育1 h，依次置于蛋白一抗(1∶1 000，4℃过夜)、HRP标记的蛋白二抗(1∶5 000，37℃ 40 min)中，最后添加ECL发光剂进行显影，Image J软件检测蛋白质的表达水平。

1.10ELISA检测炎症因子含量 处理结束后，断头取出脑组织，应用生理盐水制备10%脑组织匀浆液，3 500 r/m离心15 min，取上层血清，参照ELISA试剂盒说明书操作，检测脑组织匀浆液中白细胞介素(IL)-6、IL-1β及肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量。

1.11统计学方法 应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、LSD检验。

2 结 果

2.1大鼠神经功能缺失、脑水肿及脑梗死情况 与假手术组比较，模型组大鼠神经损伤评分、脑组织含水量及脑梗死体积明显增加(P<0.05)；与模型组比较，银杏叶提取物低、高剂量组神经损伤评分、脑梗死体积、银杏叶提取物及高剂量组脑组织金水量明显降低，且高剂量组脑梗死体积改善显著优于低剂量组(P<0.05)。见表1。

2.2大鼠血脑屏障的通透性 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织伊文思蓝含量明显增加，脑组织中紧密连接蛋白(Claudin-5)和Occludin表达明显降低(P<0.05)；与模型组比较，银杏叶提取物高剂量组伊文思蓝含量明显降低，Claudin-5和Occludin表达明显增加，高剂量组Clandin-5改善显著优于低剂量组(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组神经功能缺失、脑水肿及脑梗死情况及血脑屏障通透性

1～4：假手术组，模型组，银杏叶提取物低剂量组，银杏叶提取物高剂量组；图3、4同图1 大鼠脑组织中紧密连接相关蛋白的表达

2.3大鼠脑组织细胞的凋亡 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织细胞凋亡率、脑组织中切割后半胱氨酸天冬氨酸酶(cleaved caspase)-3和cleaved caspase-9表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，银杏叶提取物组凋亡率、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达降低，除低剂量组凋亡率外，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2、图3、表2。

图2 各组脑组织细胞的凋亡情况(TUNEL，×200)

图3 各组脑组织中凋亡相关蛋白的表达

2.4大鼠脑组织匀浆液中炎症因子水平 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织匀浆液中IL-6、IL-1β及TNF-α含量明显增加(P<0.05)；与模型组比较，银杏叶提取物组IL-6、IL-1β及TNF-α含量明显降低，高剂量组TNF-α改善显著优于低剂量组(P<0.05)。见表2。

2.5大鼠脑组织磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路表达 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中磷酸化(p)-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，银杏叶提取物高剂量组p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT水平明显增加，高剂量组p-Akt/Akt改善显著优于低剂量组(P<0.05)。见表2、图4。

表2 各组脑组织细胞凋亡、炎症因子水平及PI3K/Akt磷酸化水平比较(ng/L，n=15)

图4 大鼠脑组织中PI3K/AKT的表达

3 讨 论

脑水肿是急性脑梗死患者病情恶化和死亡的常见原因，局部缺血缺氧后，脑组织内钠-钾离子代谢失衡，细胞间水分将进入胞内，产生细胞毒性水肿。相较于细胞毒性水肿，血管性水肿与血脑屏障的密切相关。脑梗死后脑组织中炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等病理损伤过程，可破坏血脑屏障，进一步加重脑损伤，形成恶性循环，扩大脑内组织损伤范围。因此，减轻继发性脑损伤和保护血脑屏障是急性脑梗死的重要治疗策略。

本研究结果显示，银杏叶提取物可有效降低模型大鼠神经损伤评分、脑梗死体积，提示银杏叶提取物对于急性脑梗死有保护作用，与既往研究结果相符〔9〕。血脑屏障是血液和脑组织之间的保护性生物膜系统，可有效组织一些异物和大分子进入脑组织，主要由脑的毛细血管壁和神经胶质细胞组成，其中紧密连接蛋白对维持血脑屏障的完整性至关重要。本研究中，银杏叶提取物处理后，大鼠脑组织含水量降低，脑组织中伊文思蓝的渗透量减少，紧密连接蛋白主要成分Claudin-5、Occludin表达增加，提示银杏叶提取物可能通过增加紧密连接蛋白表达，保护血脑屏障。

脑组织供血血管出现急性闭塞后，缺血区会爆发强效、持久的炎症反应，分泌及释放IL-6、IL-1β、TNF-α、趋化因子及黏附分子等多种炎性因子，诱使周围细胞的死亡，破坏血脑屏障，进一步扩大病变区域。因此，积极控制急性脑梗死患者体内炎症反应水平，不仅可以防止脑损伤进展，还可减轻血脑屏障损伤。本研究结果显示，银杏叶提取物处理后，急性脑梗死大鼠脑组织匀浆液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低，这与Gargouri等〔10〕研究报道银杏叶提取物的抗炎活性相符。

PI3K/AKT信号通路是细胞内重要的信号转导通路，也广泛存在于各类神经细胞中，对于细胞增殖、分化、代谢、凋亡等生物学过程具有调节作用。Xiong等〔11〕研究指出，沉默血小板衍生生长因子(PDGF)后可通过抑制PI3K/AKT通路，诱导新生儿缺氧缺血后神经元凋亡。Chang等〔12〕研究发现，小RNA634可通过PI3K/AKT通路，抑制脑梗死大鼠神经细胞的凋亡。Cao等〔13〕研究显示，银杏叶提取物可介导PI3K/AKT信号通路调控黑色素瘤细胞的转移能力。TUNEL染色和蛋白印迹检测结果显示，银杏叶提取物可降低模型大鼠脑组织细胞的凋亡，减少脑组织中凋亡关键蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达，并提高PI3K和AKT的磷酸化水平，提示银杏叶提取物可能通过促进PI3K/AKT信号通路的活化，抑制急性脑梗死大鼠脑组织细胞的凋亡。

综上，银杏叶提取物可改善急性脑梗死模型大鼠神经功能，保护血脑屏障功能，可能与抑制脑组织细胞凋亡、减轻脑内炎症反应、活化PI3K/AKT信号通路有关。但银杏叶提取物用于急性脑梗死的治疗，仍需要更多的证据支持。