长链非编码RNA TUBA4B与Ⅱ型子宫内膜癌患者预后的关系

郭艳娟 赵楠楠 周剑利 董建新 袁金灵 高 杰

华北理工大学附属医院妇产科，河北唐山 063000

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）位居女性全身恶性肿瘤第四位[1]。近年来，全球EC 发病率和病死率逐年升高，且有年轻化趋势[2]。Ⅱ型EC 是一种非雌激素依赖性上皮样癌，占EC 的10%～20%，因其具有高度侵袭性，预后极差[3]，故探究预示Ⅱ型EC 预后的生物标志物具有重要意义。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一种由200 个及以上核苷酸组成的RNA，不具备编码蛋白质功能[4]。目前，已有多数lncRNA 被报道参与EC 发病和进展过程，如lncRNA miR143HG[5]、lncRNA NEAT1[6]和lncRNA DCST1-AS1[7]等。lncRNA TUBA4B是lncRNA 家族成员之一，已被报道可靶向miR-26b/PTEN 通路抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力，并促进其凋亡[8]。miR-26b/PTEN 通路与EC 细胞的侵袭和迁移关系密切[9]，有理由认为lncRNA TUBA4B 与EC 有关，其水平或可反映EC 患者的预后。本研究分析lncRNA TUBA4B 与Ⅱ型EC 预后的关系，以期为评估Ⅱ型EC患者的预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013 年3 月至2017 年7 月在华北理工大学附属医院（以下简称“我院”）就诊的123 例Ⅱ型EC患者作为研究对象。参照《子宫内膜癌诊断与治疗指南（第四版）》[10]诊治Ⅱ型EC。纳入标准：①经手术病理确诊为Ⅱ型EC；②配合完成本研究所需相关检查。排除标准：①复发的EC；②病理检查前接受化疗、放疗等。123 例Ⅱ型EC 患者年龄34～69 岁，平均（54.76±7.04）岁；浆液性乳头状腺癌75 例，透明细胞癌40 例，恶性米勒管混合瘤3 例，未分化癌5 例；低分化47 例，中分化45 例，高分化31 例；浸润深度≤1/2 肌层48例，＞1/2 肌层75 例；淋巴结转移24 例；子宫外转移24 例；国际妇产科联盟分期（International Federation of Gynecology and Obste-trics staging，FIGO 分期）Ⅰ期70 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期19 例，Ⅳ期11 例；手术治疗41 例，手术治疗+化疗20 例，手术治疗+放疗36 例，手术治疗+化疗+放疗26 例。本研究所有患者均知情同意，并签署了知情同意书。本研究经我院医学伦理委员会批准（编号：20200228002）。

1.2 随访

用复诊及电话随访方式进行随访，于出院后1 个月开始随访，每3 个月随访1 次，末次随访时间为2020 年8 月17 日，中位随访时间为36 个月。本研究随访终点为随访过程中死亡或至末次随访结束，期间无失访患者。

1.3 lncRNA TUBA4B 水平检测

用实时荧光定量PCR 法[11]检测lncRNA TUBA4B水平，步骤如下：①取EC 组织，将其研磨为组织匀浆，用TRIzol 试剂提取总RNA；②用紫外分光光度计（上海光学仪器五厂有限公司）检测RNA 纯度，吸光度值比（OD260/280）在1.9～2.0；③取2 μg 的RNA，用逆转录试剂盒（日本TAKARA 公司，批号：6110A1）将RNA 逆转录成cDNA；④用PCR 仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]扩增cDNA，扩增条件为95℃5 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，35 个循环。用2-△△Ct计算lncRNA TUBA4B 的水平。本研究引物由上海吉玛制药技术有限公司设计，lncRNA TUBA4B 序列正向引物：5’-CCCACAGGCTTTAAGGTTGA-3’，反向引物：5’-AGGCCATAGTGATGGCTGTC-3’；内参GAPDH 序列正向引物：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，反向引物：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。

1.4 统计学方法

采用3.6.3 版R 软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t 检验，计数资料采用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者操作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）评价lncRNA TUBA4B 对EC 预后的诊断价值。采用Kaplan-Meier 绘制TUBA4B 水平的生存曲线，采用Log-Rank 法进行比较。采用Cox 回归分析EC 预后的风险因素。采用限制性立方样条拟合Cox 回归分析lncRNA TUBA4B与EC 预后的关系。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组lncRNA TUBA4B 水平比较

Ⅱ型EC 患者1、2、3 年总生存率分别为90.24%（111/123）、71.54%（88/123）和66.67%（82/123）。根据Ⅱ型EC 患者3 年预后情况将其分为生存组（82 例）和死亡组（41 例）。生存组lncRNA TUBA4B 水平为（0.81±0.09），高于死亡组的（0.69±0.07），差异有统计学意义（t=7.204，P ＜0.001）。

2.2 lncRNA TUBA4B 诊断Ⅱ型EC 预后的价值

lncRNA TUBA4B 诊断Ⅱ型EC 预后的ROC 曲线下面积、最佳截断点、约登指数、敏感度和特异度分别为0.836（95%CI：0.757～0.914）、0.70、0.585、63.41%和95.12%。见图1。

图1 lncRNA TUBA4B 诊断Ⅱ型EC 预后的ROC 曲线

2.3 两组生存情况分析

根据lncRNA TUBA4B 诊断Ⅱ型EC 预后的最佳截断点将123 例Ⅱ型EC 患者分为高TUBA4B 组（93 例）和低TUBA4B 组（30 例）。高TUBA4B 组中位生存时间为36 个月，高于低TUBA4B 组的13 个月，差异有统计学意义（Log-Rank χ2=104.897，P ＜0.001）。见图2。

图2 两组生存曲线比较

2.4 影响Ⅱ型EC 预后因素的Cox 回归分析

将Ⅱ型EC 患者3 年生存预后作为因变量，将年龄、肿瘤病理类型、分化程度、FIGO 分期、治疗方式和lncRNA TUBA4B 作为自变量（变量赋值见表1），纳入Cox 单因素分析，结果显示分化程度、FIGO 分期、治疗方式和lncRNA TUBA4B 均与Ⅱ型EC 预后有关（P ＜0.05）。见表2。将分化程度、FIGO 分期、治疗方式和lncRNA TUBA4B 作为自变量，纳入Cox 多因素分析，结果显示FIGO 分期高和治疗方式复杂是Ⅱ型EC 预后的独立危险因素（P ＜0.05），分化程度高和lncRNA TUBA4B 水平高是Ⅱ型EC 预后的独立保护因素（P ＜0.05）。见表2。

表1 变量赋值

表2 影响Ⅱ型EC 预后因素的Cox 回归分析

2.5 lncRNA TUBA4B 与Ⅱ型EC 预后的相关性分析

用限制性立方样条拟合Cox 回归分析lncRNA TUBA4B 与Ⅱ型EC 预后的关系，当节点个数为5 时，AIC 值最小（AIC=298.723），此时，结果显示lncRNA TUBA4B 与Ⅱ型EC 预后有关（χ2=68.83，P ＜0.001），呈非线性关系（χ2=18.76，P ＜0.001）。以lncRNA TUBA4B 诊断Ⅱ型EC 预后的最佳截断点作为参考点，当lncRNA TUBA4B≥0.70 时，Ⅱ型EC 预后不良风险降低；当lncRNA TUBA4B＜0.70 时，Ⅱ型EC 预后不良风险升高。见图3。

图3 lncRNA TUBA4B 与Ⅱ型EC 预后的剂量-反应图

3 讨论

Ⅱ型EC 具有高度侵袭性，治疗效果尚不理想，预后不良风险高[12-15]。近年来，随着医学技术的发展，Ⅱ型EC 的无进展生存期和总生存期已有一定改善，但总体预后较Ⅰ型EC 仍不乐观[16-20]。本研究随访了解到123 例Ⅱ型EC 患者1、2 和3 年总生存率分别为90.24%、71.54%和66.67%，该结果与蓝喜等[3]研究结果接近。

本研究结果显示生存组lncRNA TUBA4B 水平高于死亡组，提示lncRNA TUBA4B 水平与Ⅱ型EC 预后有关，其水平或可评价预后。遂构建lncRNA TUBA4B诊断Ⅱ型EC 预后的ROC 曲线，结果显示其曲线下面积、敏感度和特异度分别为0.836、63.41%和95.12%，表明lncRNA TUBA4B 对于Ⅱ型EC 患者预后评估有一定价值，但敏感度低，可辅助用于评价Ⅱ型EC预后。

既往研究[3,21-26]表明EC 分化程度、肌层浸润深度、淋巴结转移、子宫外转移、FIGO 分期和治疗方式等均与Ⅱ型EC 预后密切相关。为避免混杂因素及各因素间共线性等问题，仅将Ⅱ型EC 患者年龄、肿瘤病理类型、分化程度、FIGO 分期、治疗方式和lncRNA TUBA4B纳入了Cox 回归分析，结果显示FIGO 分期高和治疗方式复杂是Ⅱ型EC 预后的独立危险因素，分化程度高是Ⅱ型EC 预后的独立保护因素，与上述研究结果一致。

本研究结果还显示，lncRNA TUBA4B 水平高是Ⅱ型EC 预后的独立保护因素。限制性立方样条拟合Cox 回归结果显示当lncRNA TUBA4B＞0.70 时，Ⅱ型EC 预后不良风险降低；当lncRNA TUBA4B＜0.70 时，Ⅱ型EC 预后不良风险升高。推测其原因是lncRNA TUBA4B 调节miR-26b/PTEN 通路参与EC 细胞的侵袭和迁移，进而影响EC 预后，检测其水平可了解EC预后情况。

本研究尚存在一定不足，一是因Ⅱ型EC 发病率偏低，致使本研究纳入的样本量偏小，分析结果可能存在一定偶然性；二是未开展基础研究分析lncRNA TUBA4B 是否通过调控miR-26b/PTEN 通路参与EC细胞的侵袭、迁移等过程。鉴于本研究存在以上不足，为更好地了解lncRNA TUBA4B 与Ⅱ型EC 预后的关系，还需开展大样本、前瞻性研究验证本研究结果，同时开展基础研究分析lncRNA TUBA4B 影响Ⅱ型EC预后的病理生理机制。

综上所述，lncRNA TUBA4B 水平与Ⅱ型EC 预后有关，检测其水平有助于评价患者预后。LncRNA TUBA4B 水平高提示患者预后不良风险低。