丁酸钠协同成纤维细胞生长因子2 体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

赵亚如 刘 洋 吕 洋 王文华 王浩宇 王巧敏 王海萍

河北北方学院组织学与胚胎学教研室，河北张家口 075000

随着饮食结构的改变，缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD）患病率逐渐升高，临床一般采用药物、介入或者搭桥等传统治疗，但这些方法只是缓解症状，心肌细胞（cardiac myocytes，CMs）如果在心肌缺血区域内坏死，会形成纤维性瘢痕组织，从而发展为心力衰竭。通过临床前研究表明，随着骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC）移植，梗死面积总体减少了约7%，心功能改善了约11%[1]。研究发现，通过加入化合物或者细胞因子、基因修饰、微环境的调节和物理因素刺激等都可以促进BMMSC 向CMs 分化[2-4]。丁酸钠通过抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），使转录激活，从而促使BMMSC 向CMs 分化[5]，但低浓度的丁酸钠抑制细胞增殖[6]，这限制丁酸钠诱导分化的能力。成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF-2）可以通过ERK 和JNK 途径协同调节细胞增殖再生[7-8]；丁酸钠可以抑制HDAC 促进FGF-2 生成[9-10]，因此为了提高其分化的效率，本研究选择FGF-2 与丁酸钠联合诱导BMMSC 向CMs 分化。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂

SPF 级2～3 周龄SD 大鼠（25±10）g 购自北京斯贝福生物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0002，合格证号：No.1103241911030990]，实验过程遵循3R 原则。

流式细胞仪和鼠抗缝隙连接蛋白43（connexin 43，CX43）抗体（货号：610061）购自美国BD 公司；免疫细胞化学染色试剂盒（货号：SP-9000）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）抗体（货号：GTX109331）购自美国Gene Tex 公司；兔抗Desmin 抗体（货号：ET1606-30）购自河北华安生物药业有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 BMMSC 的分离和纯化 2～3 周龄SD 大鼠，颈椎脱臼、医用酒精消毒，依次取出四肢长骨，用含有Pen-Strep 的PBS 冲洗骨髓腔，放入细胞培养瓶中，置于恒温培养箱中。培养48 h 后更换培养基，以后每隔72 h换1 次培养基，当贴壁细胞融合至90%左右进行传代。

1.2.2 BMMSC 的鉴定 第3 代BMMSC 做流式，消化、吹打为细胞悬液，均匀分装到3 个离心管中，第1 个加适 量CD29-PE 抗 体、CD45-FITC 抗 体、CD90-PECyTM7 抗体，第2 个加入适量PE 抗体、FITC 抗体、PECyTM7 抗体，第3 个加入适量PBS，4℃避光孵育30 min，上机检测。

1.2.3 BMMSC 体外诱导分化 取第3 代细胞进行诱导培养，分为4 组，对照组：加入普通完全培养基，丁酸钠组：加入浓度为1 mmol/L 丁酸钠培养基，FGF-2组：加入1 ng/ml FGF-2 的培养基，联合组：加入含有浓度为1 mmol/L 丁酸钠和1 ng/ml FGF-2 的培养基。培养72 h 后，全部换成普通完全培养基，继续培养4 周。

1.2.4 定量反转录PCR（quantitative reverse transcriptase-mediated PCR,qRT-PCR）对心肌特异性基因的检测 分别提取经药物诱导后1、2和4 周总RNA，反转录为cDNA，以GAPDH 为内参，对目的基因GATA-4 进行扩增，GAPDH 正向引物20 bp：5’-ACTCTACCCACGGCAAGTTC-3’，反向引物20 bp：5’-TGGGTTTCCCGTTGATGACC-3’；GATA-4 正向引物20 bp：5’-TTTTATCCGCGAGCCTACGG-3’，反向引物20 bp：5’-AGGTACCGCTGTTGCTTGAA-3’，2-△△Ct相对定量分析数据，观察目的基因的表达。

1.2.5 Western blot 检测心肌特异性蛋白的表达诱导4 周后的细胞，消化、离心收集细胞，加入裂解液，在4℃冰箱50 min，测蛋白浓度；在蛋白样品中添加适量的蛋白上样缓冲液；把蛋白样品加到各个上样孔内，进行电泳、转膜、封闭，一抗（1∶1000）孵育膜，4℃、摇床过夜，二抗（1∶10 000）室温孵育膜，ECL 化学发光、成像仪成像、最后图像分析。

1.2.6 免疫组织化学测心肌特异性蛋白的表达 取诱导4 周后的细胞，消化、计数细胞，然后爬片，多聚甲醛固定，用0.5% TritonX-100 室温透膜20 min；内源性过氧化物酶阻断剂室温15 min；滴加山羊血清，37℃温箱15 min；滴加一抗（1∶100）4℃过夜；复温30 min 后加生物素标记的羊抗兔IgG，室温20 min；滴链酶卵白素－过氧化物酶，37℃15 min；滴加DAB，室温显色2 min；染核、分化、反蓝、脱水、透明、树脂封片，采集图片。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行资料分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验，多组间比较采用重复测量方差分析和单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学观察结果

原代细胞接种至培养瓶中呈悬浮状态，培养48 h后，首次换液细胞贴壁数量明显增加并且开始出现形态改变见图1A（封三）；培养1 周的BMMSC 细胞进一步伸展，出现梭形、多角形和不规则形等多种形态见图1B（封三）；诱导培养4 周后的BMMSC，相邻细胞间具有明显的方向性排列，一些细胞甚至成了漩涡样结构见图1C（封三）；联合组诱导4 周后，相邻细胞间排列的方向性，漩涡样结构与其他诱导组相比较更加明显见图1D（封三）。

图1 BMMSC 的培养与诱导

2.2 表面抗原鉴定结果

用流式细胞仪测第3 周BMMSC 的表面抗原。最后测得表面抗原CD29、CD45、CD90 的阳性表达率分别为93.3%、1.4%、95.1%。结果显示全骨髓贴壁法分离培养的细胞为纯化的BMMSC。见图2。

图2 BMMSC 流式细胞术的鉴定

2.3 qRT-PCR 结果

整体分析：各组GATA-4 基因的表达、时间点及分组和时间交互作用比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。组内比较：经药物诱导后的三组细胞诱导2 周GATA-4 基因的表达均高于诱导1、4 周，差异有统计学意义（P ＜0.05）；诱导4 周基因的表达高于诱导1 周，差异有统计学意义（P ＜0.05）。组间比较：经药物诱导后联合组诱导2 周GATA-4 基因的表达高于其他各组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；联合组诱导1、4 周GATA-4 基因的表达与其他各组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 四组GATA-4 mRNA 表达水平比较（，n=3）

表1 四组GATA-4 mRNA 表达水平比较（，n=3）

注：与同组诱导1 周比较，aP ＜0.05；与同组诱导2 周比较，bP ＜0.05；与同期对照组比较，cP ＜0.05；与同期丁酸钠组比较，dP ＜0.05；与同期FGF-2 组比较，eP ＜0.05。FGF-2：成纤维细胞生长因子2

2.4 Western blot 检测结果

联合组CX43、结蛋白（Desmin）和cTnI 蛋白的表达量均高于其他各组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。丁酸钠组和FGF-2 组CX43、Desmin 和cTnI 蛋白的表达量均高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；FGF-2 组cTnI 蛋白的表达量高于丁酸钠组，差异有统计学意义（P ＜0.05），两组CX43、Desmin 蛋白的表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图3，表2。

表2 四组心肌特异性肌蛋白的表达水平比较（，n=3）

表2 四组心肌特异性肌蛋白的表达水平比较（，n=3）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与丁酸钠组比较，bP ＜0.05；与FGF-2组比较，cP ＜0.05。CX43：缝隙连接蛋白43；Desmin：结蛋白；cTnI：心肌肌钙蛋白I；FGF-2：成纤维细胞生长因2 子

图3 Western blot 结果

2.5 免疫组化检测结果

BMMSC 诱导4 周后，联合组心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）和cTnI 蛋白的表达量高于其他各组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；FGF-2 组cTnT 和cTnI 蛋白的表达量高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），FGF-2 组的cTnT 高于丁酸钠组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；丁酸钠组cTnT 和cTnI 蛋白的表达量高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

表3 四组CTnT、CTnI 的阳性率比较（%，，n=3）

表3 四组CTnT、CTnI 的阳性率比较（%，，n=3）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与丁酸钠组比较，bP ＜0.05；与FGF-2组比较，cP ＜0.05。cTnT：心肌肌钙蛋白T；cTnI：心肌肌钙蛋白I；FGF-2：成纤维细胞生长因子2

3 讨论

近年来，将外源性干细胞移植入受损的心脏中，得到了广泛研究和认可[11-12]。干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。因间充质干细胞较胚胎干细胞具有低的免疫原性、获取相对容易、没有道德问题等特性，使它被广泛研究用于心肌再生[13-14]。

丁酸钠具有显著的诱导分化的特点，它可以通过Wnt 通路诱导干细胞向神经分化[15]；通过激活ERK 调控Runx2 基因的表达刺激干细胞分化成骨细胞[16]等。因GATA-4 和MEF-2c 为心肌特异性转录因子[17]，丁酸钠通过促进GATA-4 和MEF-2c 心脏特异性转录因子组蛋白乙酰化，使其与目标DNA 结合，从而促进干细胞向CMs 的分化[18-19]。FGF-2 是刺激干细胞迁移、增殖和分化的强力有丝分裂原，FGF-2 不仅能促进干细胞分化为心肌细胞，还可以重编程成纤维细胞为心肌样细胞[20]。本研究运用二者联合和单独诱导BMMSC 细胞3 d，比较他们之间的分化效率。

cTn 是心肌收缩的调节蛋白，由3 种亚基组成：cTnT、cTnI 和TnC，cTnI 和cTnT 是特定于心肌，用于心脏病实验室诊断[21-22]。CX43 主要存在于心脏内，位于CMs 间隙连接处，以促进动作电位的传播[23]。Desmin是中间丝的主要蛋白质成分，在心脏中表达丰富[24]。BMMSC 经药物诱导4 周后，从蛋白水平和基因的表达水平表明，联合组明显高于其他组，这个结果可能是因为丁酸钠的受体和FGF-2 的受体可以一起形成异源复合物，并触发细胞内信号PI3K 和ERK 通路的表达[25]。

以上研究结果显示，丁酸钠和FGF-2 诱导BMMSC向心肌样细胞分化，联合比单独诱导效果好，为临床优化治疗IHD 的细胞疗法提供理论支持。