槲皮素的抗炎免疫及部分机制研究

司丽君 王 雪 王林林 黄 华

新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐 830004

槲皮素（分子式：C15H10O7）是一种在植物中广泛存在的黄酮类化合物[1]，其具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]、免疫调节[6]等多种药理活性。槲皮素也是新疆一枝蒿[7]、滨蒿[8]、天山雪莲[9]、金莲花[10-11]、沙棘[12]、沙枣[13]等具有抗炎作用的新疆地产民族药的成分之一。研究表明，槲皮素对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导RAW264.7 细胞释放的一氧化氮、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6 和IL-1β 有显著的抑制作用[14-16]，且槲皮素可以增强免疫低下小鼠的免疫力[17]，但其对活性氧（reactive oxygen species，ROS）、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）和环氧合酶（cyclooxygenase，COX）的体外抑制作用，以及对正常小鼠免疫功能的影响少见报道。本研究通过进一步考察槲皮素对ROS、MCP1 和COX 的影响，并观察槲皮素对正常小鼠脾淋巴细胞、T 细胞和B 细胞增殖的影响，探讨槲皮素的抗炎和免疫调节作用，以期为槲皮素在炎症及免疫疾病中的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及动物

RAW264.7 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；SPF 级BALB/C 雄性小鼠20 只，6～8 周龄，体重18～22 g，购自新疆医科大学动物实验中心，经新疆药物研究所动物伦理委员会批准（XJIMM-2019004-1），实验动物生产许可证号：SCXK（新）2018-0002，实验动物质量合格证号：65000700001086。

1.2 主要试剂与仪器

槲皮素（中国药品生物制品检定所，含量为99.1%，批号：100081-201610）；LPS（Sigma，货号：L2880）；伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，Con A）（Solarbio，货号：C8110）；2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Sigma，货号：D6883）；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒[Thermo Fisher，TNF-α 货号：88-7324；IL-6 货号：88-7064；γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）货号：88-7314]，MCP1（武汉华美，货号：CSB-E07430m）；COX 抑制剂筛选试剂盒（Cayman Chemical Company，货号：700100）；微孔板检测仪，美国美谷分子仪器（型号：SpectraMax M2）。

1.3 研究方法

1.3.1 RAW264.7 细胞采用含10%胎牛血清的1640 培养基培养，以2×104个/孔接种在96 孔板中，采用不同浓度的槲皮素（125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、1.95、0.98、0 μg/ml）对其进行干预，每组4 个复孔。观察其对RAW 264.7 细胞活力的影响，采用MTS 法检测细胞活力，选择对细胞活力无影响的浓度的槲皮素以进行下一步研究。

1.3.2 以无处理的RAW 264.7 细胞为空白组，采用1 μg/ml LPS 刺激RAW 264.7 细胞建立炎症细胞模型[8]，将其分为模型组，槲皮素0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml剂量组，每组4 个复孔。采用MTS 法检测细胞活力，DCFH-DA 法测定ROS 含量[8]，ELISA 检测MCP1 水平。

1.3.3 按照COX 抑制剂筛选试剂盒说明书进行检测，计算抑制率：抑制率=（100%酶活性对照组-给药组）/100%酶活性对照组×100%。以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，非线性回归求得IC50值。

1.3.4 将小鼠处死，参考文献[18]制备细胞密度为2×106个/ml 的脾淋巴细胞悬液，接种于96 孔板，每孔100 μl，采用不同浓度的槲皮素（7.80、3.90、1.95、0.98、0 μg/ml）对小鼠脾淋巴细胞进行干预，观察其对细胞增殖情况的影响。以无处理的小鼠脾淋巴细胞为对照组，将经LPS（10 μg/ml）或Con A（8 μg/ml）处理的小鼠脾淋巴细胞分为LSP 组、Con A 组，以及槲皮素0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml 剂量组，每组4 个复孔。采用MTS 法检测不同浓度槲皮素对小鼠脾淋巴细胞、Con A 诱导的T 细胞和LPS 诱导的B 细胞增殖情况，采用ELISA试剂盒检测Con A 组及槲皮素各浓度组中TNF-α、IL-6、INF-γ 的水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Scheffe 法。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度槲皮素对RAW 264.7 细胞活力的影响

槲皮素＜7.80 μg/ml 时RAW 264.7 细胞活力与未处理时比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1。

图1 不同浓度槲皮素对RAW 264.7 细胞活力的影响（n=4）

2.2 不同浓度槲皮素对LPS 诱导的RAW 264.7 细胞ROS 和MCP1 水平的影响

模型组ROS、MCP1 含量高于空白组，槲皮素0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml 剂量组ROS、MCP1 含量低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图2。

图2 不同浓度槲皮素对LPS 诱导的RAW 264.7 细胞ROS 和MCP1 水平的影响（n=4）

2.3 槲皮素对COX-1、COX-2 抑制活性的影响

槲皮素对COX-1、COX-2 的IC50分别为12.73、0.44 μg/mL，COX-2 与COX-1 的IC550比值为0.034。

2.4 不同浓度槲皮素对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

槲皮素浓度为0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml 时小鼠脾淋巴细胞增殖均高于未处理时，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图3。

图3 不同浓度槲皮素对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（n=4）

2.5 不同浓度槲皮素对小鼠T、B 细胞增殖及T 细胞中TNF-α、IL-6 和INF-γ 水平的影响

Con A 组T 细胞及LPS 组B 细胞均高于对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。槲皮素1.95、3.90、7.80 μg/ml 剂量组T 细胞低于Con A 组，槲皮素3.90、7.80 μg/ml 剂量组B 细胞低于LPS 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图4。Con A 组TNF-α、IL-6 和INF-γ水平均高于对照组，槲皮素1.95、3.90、7.80 μg/ml剂量组TNF-α 水平低于Con A 组，槲皮素各剂量组IL-6 和INF-γ 水平均低于Con A 组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），见图5。

图4 不同浓度槲皮素对小鼠T、B 细胞增殖的影响（n=4）

图5 不同浓度槲皮素对小鼠T 细胞中TNF-α、IL-6 和INF-γ 水平的影响（n=4）

3 讨论

LPS 刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7 是评价药物抗炎活性的经典炎症细胞模型。本研究通过RAW264.7炎症模型发现，槲皮素可减少炎症细胞ROS 和MCP1的释放。ROS 具有细胞毒性，可引起DNA 损害、脂质过氧化增强、氨基酸氧化反应破坏及细胞凋亡[19]。MCP1 可促进炎症反应的发生，对单核/巨噬细胞具有特异性趋化激活作用[20-21]。本研究结果显示，槲皮素对炎症细胞中ROS 和MCP1 的释放均有很好的抑制作用。

花生四烯酸炎症代谢网络中的COX 是抗炎药物的重点靶标[22-23]。研究发现，药物对COX-1 的抑制可引起不良反应，而对COX-2 的抑制则产生抗炎作用，COX-2 选择性抑制剂将使药物的安全性大大提高。COX-2 抑制剂选择性是通过体外试验测定COX-2与COX-l 的IC50比值来筛选的[24]，本研究结果显示，槲皮素对COX-2 与COX-l 的IC50比值为0.034，提示槲皮素是COX-2 选择性抑制剂。

本研究显示槲皮素能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，又能抑制其T、B 细胞的增殖，抑制T 细胞分泌TNF-α、IL-6、INF-γ，这是否与槲皮素可以抑制抗CD3+和抗CD28+活化的初级人类T 细胞的增殖及减少IL-2 的产生有关[25]，有待进一步研究。

综上所述，槲皮素具有选择性抑制COX-2、巨噬细胞炎症反应的作用，还能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，抑制T、B 细胞的增殖。本研究有助于揭示槲皮素在调控炎症及免疫疾病中的潜在应用价值。槲皮素的炎症保护作用及免疫调节的具体分子机制及靶点还有待于今后的进一步深入研究。