云芝五味子浸膏对柳氮磺胺吡啶致小鼠肝损伤的影响

于海涛 王群英 苗 青 董文珠

1.解放军海军第九七一医院消化内科，山东青岛 266071；2.解放军海军第九七一医院药剂科，山东青岛 266071

近年来，临床上药源性肝损伤病例日益增多，其中过量使用抗菌药物是引起肝损伤的重要原因[1-2]。柳氮磺胺吡啶属于磺胺类抗菌药物，临床常用于溃疡性结肠炎的治疗。但由于其具有一定的肝毒性，甚至会引起部分患者发生肝衰竭[3]，导致柳氮磺胺吡啶的临床应用受到限制。但在类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等疾病的治疗上，柳氮磺胺吡啶具有良好的效果，具有一定的临床价值。因此，如何防止或减轻其造成的肝损害，仍是一个值得研究的重要课题[4-5]。随着现代生物技术的进步，临床发现多种中药都具有良好的保肝作用。然而保肝药物通常具有一定的特异性，针对不同原因引起的肝损伤效果可能不同，这些保肝中药对于柳氮磺胺吡啶所致肝损伤是否有效目前还缺乏具体的理论研究。云芝是一种常用中药，研究显示其具有保肝消炎、抗氧化等生物活性[6-8]，有报道认为云芝多糖对酒精、对乙酰氨基酚、四氯化碳导致的肝损伤具有良好的保护效果[9-11]。五味子同样是一种常见的具有保肝作用的中药，已经被临床广泛应用。近期有研究发现，云芝五味子浸膏对于急性酒精性肝损伤具有明显的保护作用[12]，因此本研究选取云芝五味子浸膏观察其对柳氮磺胺吡啶引起的小鼠肝损伤的保护作用，期望找出针对此种肝损伤保护效果较好的中药。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SPF 级ICR 小鼠，体重18～22 g，6 周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号为SCXK（湘）2016-0002，实验动物合格证号：430727180 101883282。饲养室内温度控制为20～22℃，湿度40%～60%，8:00—20:00 为光照时间。

1.2 药品和试剂

柳氮磺胺吡啶（S129986），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；熊去氧胆酸（20180206），购自德国福克制药；五味子、云芝购自中国人民解放军海军第九七一医院，均符合2015 年版《中华人民共和国药典》[13]的相关项下要求；谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）（20180704）、谷草转氨酶（glutamicoxaloacetic transaminase，GOT）（20180704）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（20180704），购自上海复星长征医学科学有限公司。

1.3 仪器

GA-PSU 独立送风隔离笼具（苏州市冯氏实验动物设备有限公司）；90i 全自动显微图像分析系统（日本尼康公司）；AU400 全自动生化分析仪（日本奥林巴斯公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 药液的制备 云芝五味子浸膏提取过程：将云芝600 g 和五味子120 g 清洗干净，加入10 倍量蒸馏水，蒸煮3 h；再加入10 倍量蒸馏水，继续蒸煮3 h，8 层纱布过滤，所得滤液即为所需药物[12]。后续使用生理盐水将其稀释为所需浓度。柳氮磺胺吡啶和熊去氧胆酸均混悬于0.5%羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液，使药物浓度分别为0.100 g/ml和0.001 g/ml。

1.4.2 动物分组 适应喂养1 周后，采用编号法对ICR小鼠进行随机编号，在电脑上从每6 只中随机抽取1 只编入一组，共设6 组，每组10 只。分别为对照组，模型组，熊去氧胆酸组，云芝五味子浸膏低、中、高剂量组。

1.4.3 造模方法 除对照组外，其余各组均每日以柳氮磺胺吡啶溶液（1000 mg/kg，混悬于0.5%CMC-Na）灌胃给药制备肝损伤模型；熊去氧胆酸组和云芝五味子浸膏低、中、高剂量组在柳氮磺胺吡啶给药2 h 后，分别给予熊去氧胆酸（10 mg/kg）和云芝五味子浸膏溶液（50、100、300 mg/kg）灌胃；模型组与对照组给予等体积0.5% CMC-Na 溶液，给药体积为均10 ml/kg，各组干预均持续14 d。第15 天所有小鼠空腹12 h 后处死。

1.5 指标检测

各组摘眼球取血后分离血清，采用全自动生化分析仪测定GPT、GOT 和ALP 活性。脱颈处死小鼠，迅速取出肝脏，称重，固定于10%甲醛中。切出规则方形小块（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm），置于包埋盒内。流水冲洗，脱水，透明，浸蜡，包埋。切3 μm 厚石蜡切片，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光学显微镜下观察各组肝组织病理变化，并拍照。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 六组肝损伤血清学指标比较

模型组GPT、GOT、ALP 水平均高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。云芝五味子浸膏低、中、高剂量组GPT、GOT、ALP 均低于模型组，且云芝五味子浸膏中、高剂量组均低于云芝五味子浸膏低剂量组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表1。

表1 六组肝损伤血清学指标比较（U/L，）

表1 六组肝损伤血清学指标比较（U/L，）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；与云芝五味子浸膏低剂量组比较，cP ＜0.05。GPT：谷丙转氨酶；GOT：谷草转氨酶；ALP：碱性磷酸酶

2.2 各组肝脏病理组织学结果

对照组肝脏病理切片显示：该组肝细胞以中央静脉为中心，肝细胞呈放射状向周围扩散，排列有规律，肝细胞饱满、清晰可见；模型组肝细胞出现明显的炎性细胞浸润，肝细胞破裂、坏死，肝小叶失去正常结构，肝索排列紊乱；熊去氧胆酸组部分肝细胞出现肿胀，但肝小叶结构尚完整，未见明显的炎细胞浸润，较模型组明显好转；云芝五味子浸膏各组肝细胞坏死及肝小叶结构较模型组明显好转，其中云芝五味子浸膏中、高剂量组较低剂量组好转。见图1。

图1 各组病理切片（苏木精-伊红染色，200×）

3 讨论

柳氮磺胺吡啶在临床上常用于治疗溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎等，虽然效果显著，但长期使用可致患者肝脏损害甚至急性肝坏死[14-17]。因此，为了更好地发挥柳氮磺吡啶的临床治疗作用，需要找到能防止或降低其引起肝损伤的药物。本研究以柳氮磺胺吡啶诱导小鼠肝损伤为模型，旨在寻找针对柳氮磺胺吡啶所致肝损伤的保肝中药。本研究通过将柳氮磺胺吡啶对小鼠进行灌胃处理，检测到小鼠血清学肝功指标GPT、GOT 和ALP 水平较对照组显著升高，证实肝损伤模型建立成功[18]。既往研究表明，柳氮磺胺吡啶引起的肝损伤以急性肝细胞损伤为主，可以引起GPT、GOT 和ALP 的升高[15]，同时也有报道认为柳氮磺吡啶引起的肝损伤可以导致瘀胆型肝炎[19]。因此，本研究采用熊去氧胆酸作为阳性对照药。熊去氧胆酸属于传统的保肝药物，可以促进胆汁酸的分泌，保护肝细胞的细胞膜，从而发挥保肝作用[20]。

云芝是多孔菌科真菌彩绒革盖菌的干燥子实体，是一种常用中药[13]。既往研究显示，云芝具有保肝、抗肿瘤、镇痛等多种疗效。报道认为云芝多糖对于对乙酰氨基酚导致的肝损伤具有良好的保护作用[10,21]。王康乐等[9]研究发现，云芝多糖对酒精性肝损伤具有保护作用，其能有效降低酒精性肝损伤小鼠模型血清中转氨酶及血脂的水平，起到较好的保肝作用。五味子为木兰科植物五味子或华中五味子的干燥成熟果实，有研究表明，五味子提取物可改善化学物质导致的肝损伤，能明显降低肝损伤而导致的转氨酶升高，促进胆汁的正常分泌[22]。人体中具有四氯化碳毒性的代谢产物可以通过脂质过氧化造成急性肝损伤，五味子的醇提物可抵抗这一作用[23]。五味子对对乙酰氨基酚造成的肝损伤也有较好的疗效[24]。冯耀培等[12]将云芝与五味子配伍尝试研究其对急性酒精性肝损伤的保护，研究发现云芝五味子浸膏能够显著降低酒精性肝损伤小鼠中血清GPT、GOT 的水平，改善小鼠肝细胞的变性、坏死。本研究发现云芝五味子浸膏不仅能够降低柳氮磺吡啶所致肝损伤小鼠血清中GPT、GOT、ALP 的水平，同样能够改善小鼠肝细胞的排列分布，减轻炎症细胞浸润和肝细胞坏死。本研究结果显示，云芝五味子浸膏能够有效保护柳氮磺吡啶引起的肝细胞损伤。在不同剂量组中，中、高剂量组在降低血清肝功标志物和改善肝细胞结构方面较低剂量组有显著改善，但中、高剂量组之间没有明显变化，提示云芝五味子浸膏的保肝作用随着剂量的增加呈现一定的剂量相关性，但并不是剂量越高越好，仍需要寻找一个最佳的量效值。

综上所述，本研究发现云芝和五味子配伍后针对柳氮磺吡啶所致肝损伤具有较好的保护作用，为云芝和五味子的配伍使用提供了一定的理论支持。既往研究认为五味子发挥保肝作用主要与Nrf2 信号通路、p53/p21 信号通路、核因子κB 信号通路及丝裂原活化蛋白激酶信号通路有关[25]，云芝的保肝机制可能是抑制肝脏氧化应激，改善机体相关酶类及细胞因子相关[11]。云芝和五味子配伍后是否仍通过这些途径发挥保肝作用仍需要进一步的深入研究，同时云芝和五味子浸膏的临床使用也需要更多的研究提供支持。