黄芪提取物对脑微血管内皮细胞咬合蛋白和紧密连接蛋白1的影响

宋亚娟，马景红，陈胜强，李守霞，何晓丽，王银龙，张 冰，单铁英，高立威

阿尔茨海默病(AD)在年龄>65岁的人群发生率较高，病人常表现为认知障碍及行为异常，多由中枢神经系统功能渐进性衰退所致，特异性病理改变为神经细胞外间质存在异常表达的β-淀粉样蛋白(Aβ)堆积[1-3]。相关研究显示，AD病人脑组织Aβ多数透过血脑屏障从血液转运而来的[4-5]。脑部毛细血管内皮细胞和相邻细胞膜之间的紧密连接结构构成了血脑屏障的主要成分，这些成分的活性和含量变化直接影响血脑屏障的功能。本研究体外培养脑微血管内皮细胞株(BMECs)，观察β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)对细胞活力及细胞膜咬合蛋白、紧密连接蛋白-1表达的影响，经黄芪提取物干预后分析上述指标改变，探讨黄芪提取物对血脑屏障的作用机制。

1 材料与方法

1.1 脑微血管内皮细胞及实验试剂 小鼠BMECs由河北医科大学病理教研室提供；Aβ1-40由北京方程生物提供，先溶于蒸馏水中稀释为10 g/L，放入恒温箱1周，灭菌后冷藏。黄芪提取物由恒瑞康生物科技有限公司提供，滴加少量的无水乙醇震摇，再使用适量的蒸馏水配制浓度，灭菌后冷藏。噻唑蓝由上海恒远生化试剂有限公司提供，咬合蛋白及紧密连接蛋白1的第一抗体由菲恩生物科技有限公司提供。Trizol试剂、实时定量聚合酶链反应试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 将BMECs接种到底部铺有明胶的中等培养瓶里，使用培养内皮细胞特有的孵育液，放入常规的培养箱中培养，48 h更换1次细胞孵育液，待细胞几乎全部铺满瓶底时用于实验。细胞从瓶底部消化，制成单个细胞的悬液，将含1×104的细胞悬液滴加在设有6个培养孔的塑料板里，分为对照组、Aβ诱导组及黄芪提取物组。对照组：加入培养内皮细胞的培养液；Aβ诱导组：在对照组基础上加入5 μmol/L Aβ1-40；黄芪提取物组：在Aβ诱导组基础上分别加入25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL黄芪提取物。

1.2.2 噻唑蓝比色法观察细胞活力 将正常的细胞分别消化并制成含1×104的细胞悬液，滴加在设有96个培养孔的塑料板里，放入培养箱中培养24 h后使细胞生长同步化，按照1.2.1所述分为3组，每组设置6个重复培养孔，培养1 d、2 d、3 d后每孔去掉细胞培养液，依次滴入1 mg/mL的噻唑蓝溶液100 μL，在无光线的培养箱里作用4 h，吸干净每孔上清液，依次滴加适量的二甲基亚砜溶液，轻摇10 min，使底部结晶物质被完全溶解，启动酶联免疫检测仪，调节波长为490 nm，将细胞板置入仪器中，读取每孔吸光度值，分析5组细胞活力。

1.2.3 蛋白印迹法测定细胞咬合蛋白和紧密连接蛋白1 蛋白含量 使用含有6个培养孔的塑料板，将细胞分为对照组、Aβ诱导组和100 μg/mL黄芪提取物组。待细胞生长48 h后，在各孔内加入适量的用于裂解培养细胞的溶液，低温下采用超声将细胞打碎，置于低温超速离心机中，调节转速13 000 r/min，时间 10 min，结束时留取悬液检测其中蛋白质含量，同时向其内滴入2倍的十二烷基磺酸钠溶液，沸水方法使蛋白热变性，取少许蛋白加入凝胶孔中在稳定电压下进行电泳分离蛋白，之后将胶中分离蛋白条带采用电转移方式移入硝酸纤维膜中，常温下膜浸入封闭液中 1 h，浸入适当比例稀释的一抗(咬合蛋白和紧密连接蛋白1)溶液4 h，清洗膜数次后浸入二抗溶液，清洗膜数次后滴加发光试剂让其显影。含有蛋白的部位显示为不同灰度的短条影，分析灰度值评定蛋白含量。

1.2.4 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析细胞咬合蛋白及紧密连接蛋白1 mRNA表达 按照1.2.3进行细胞分组并孵育48 h后，加入Trizol提取3组细胞总RNA，将mRNA作为模板，遵循RNA逆转录流程依次操作，最后将获取的反应液滴加到实时定量荧光聚合酶链反应体系中，根据说明书依次操作，每组6个重复孔。按照说明书设置反应条件，共40个循环；获得的扩增产物采用2-△△CT计算两种蛋白mRNA相对值。

2 结 果

2.1 各组细胞活力比较 培养第1天，5个不同处理组细胞吸光度值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；经过第2天、第3天培养，与对照组比较，Aβ诱导组吸光度值随着孵育天数增加逐渐减小(P<0.05)；与Aβ诱导组比较，黄芪提取物组吸光度值随着黄芪提取物剂量增加和培养时间延长而增大(P<0.05)。详见表1。

表1 各组细胞活力比较(±s)

2.2 3组细胞咬合蛋白和紧密连接蛋白1蛋白含量比较 3个不同处理组细胞孵育次日，与对照组比较，Aβ诱导组咬合蛋白和紧密连接蛋白1相对值减小(P<0.05)；与Aβ诱导组比较，100 μg/mL黄芪提取物组咬合蛋白和紧密连接蛋白1相对值增大(P<0.05)。详见图1、表2。

对照组 Aβ诱导组 100 μg/mL黄芪 提取物组

表2 3组咬合蛋白及紧密连接蛋白1蛋白表达比较(±s)

2.3 3组咬合蛋白mRNA和紧密连接蛋白1 mRNA表达比较 3个不同处理组细胞孵育2 d，与对照组比较，Aβ诱导组咬合蛋白mRNA和紧密连接蛋白1 mRNA表达减小(P<0.05)；与Aβ诱导组比较，100 μg/mL黄芪提取物组咬合蛋白mRNA和紧密连接蛋白1 mRNA表达增加(P<0.05)。详见表3。

表3 3组细胞咬合蛋白mRNA和紧密连接蛋白1 mRNA比较(±s)

3 讨 论

导致AD发生的因素较多，这些因素的作用机制尚不明确。已明确的是AD病变神经组织内含有由大量Aβ堆积斑块、神经元胞质中神经纤维缠结，且脑部部分区域较多神经细胞不存在或缺失[6-7]。关于AD病因及机制，公认的是Aβ在神经组织大量存在并造成一系列的病理反应，最终导致发病区域较多神经细胞损伤或缺失[8-9]，因此，Aβ大量存在于神经组织是AD的始动因素。Aβ是前体蛋白(广泛存在于机体的多种细胞里)，在相关酶分解作用下的产物，可溶性产物之一Aβ1-40较易黏附于神经组织血管壁上，造成血管壁的内皮细胞等结构损伤[10]。已有研究显示，AD神经组织中Aβ多数是透过血脑屏障从血液转运而来的[4-5]。神经组织血管壁中内皮细胞和相邻细胞膜之间的紧密连接结构是组成血脑屏障的关键要素，其改变直接影响血脑屏障功能[11-13]。

血脑屏障是脑组织的血管内血液与血管外组织存在的一种结构性屏障，其结构中内皮细胞及相邻内皮细胞膜上的紧密连接是主要的结构和功能成分，紧密连接结构主要由内皮细胞膜上咬合蛋白和胞质内的紧密连接蛋白构成，两者在紧密连接结构功能上发挥着关键作用，决定着血脑屏障通透性的严密性[12，14-15]。相关文献报道，AD发病早期已出现脑组织血管功能下降，构成紧密连接结构蛋白质含量减少，对AD的发展起着促进作用[16-18]。

本研究结果与上述研究结果一致，经Aβ1-40孵育的脑组织血管内皮细胞活性下降，内皮细胞膜上咬合蛋白及细胞质中紧密连接蛋白1蛋白和mRNA含量减少；采用黄芪提取物干预后，内皮细胞活性增加，内皮细胞膜上咬合蛋白及紧密连接蛋白1蛋白和mRNA含量增多。结果提示，黄芪提取物通过提高Aβ1-40损伤的内皮细胞活性，并恢复内皮细胞膜上咬合蛋白及胞质中紧密连接蛋白1蛋白和mRNA表达维持血脑屏障结构的完整性。关于其作用的细胞内分子信号转导机制尚需进一步研究。