抗菌肽LL-37对大鼠背部皮瓣存活的影响△

何志湘，王九松，许云华，宋剑刚，贺 强

（南华大学附属南华医院手足外科，湖南衡阳 421002）

随意皮瓣因其使用方便灵活，被广泛应用于临床组织缺损的修复和重建，但随意皮瓣由于不含知名血管，皮瓣血液供应主要依靠蒂部皮肤及筋膜内的血管网，易发生皮瓣血液循环障碍和缺血再灌注损伤，造成皮瓣部分或全部坏死［1，2］。因此，改善皮瓣微循环、增加血运，减少炎性反应，对提高皮瓣的成活率至关重要。抗菌肽是一类由生物免疫系统产生的活性多肽，存在于上皮和免疫组织中，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性的特性，构成了机体先天性免疫系统的第一道防线［3，4］。LL-37 是人源抗菌肽 cathelicidin家族的一员，表达分泌于人体内多种上皮细胞、免疫细胞、体液和创伤分泌物等处，能够发挥抗微生物活性，参与机体免疫调节，还可作用于血管内皮细胞和上皮细胞，刺激血管生成和促进损伤修复［5～7］。然而，LL-37是否能够促进随意皮瓣的存活目前鲜有报道。因此，本研究拟通过研究不同剂量抗菌肽LL-37干预对大鼠随意皮瓣成活的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性Sprague–Dawley(SD)大鼠75只，6～7周龄，体质量（220.35±20.06）g，由湖南嘉泰实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（湘）2019-0003。随机分为假手术组、模型组、LL-37低剂量组（0.25 mg/kg）、LL-37中剂量组（0.5 mg/kg）和 LL-37高剂量组（1.0 mg/kg），每组15只。

1.2 模型建立与药物处理

假手术组仅切开皮瓣，立即将原位缝合，不结扎知名血管；而其它4组采用改良“McFarlane flap”法制作大鼠随意皮瓣模型［8］。术后2 h，LL-37低、中、高剂量组大鼠分别给予0.25 mg/kg、0.5 mg/kg和1.0 mg/kg LL-37腹腔注射，正常对照组和模型组大鼠注射等量生理盐水，1次/d，连续7 d。

1.3 评价指标

1.3.1 大体观察

术后1～7 d每天肉眼观察各组大鼠皮瓣色泽、组织弹性、质地和坏死范围等情况。术后7 d对各组大鼠皮瓣进行摄像拍照，通过Image-Pro plus 6.0软件分析系统测定皮瓣成活面积和总面积并计算皮瓣成活率，皮瓣存活率=成活面积/总面积×100%。

1.3.2 组织学观察与计量

术后第7 d切取大鼠皮瓣距尾端3～4 cm处组织，10%多聚甲醛溶液中固定48 h，石蜡包埋；制3 μm切片，HE染色，于显微镜下观察。另组切片按照免疫组化试剂盒说明书进行CD31染色，阳性染色呈棕黄色。先将染色切片置于低倍镜下确定血管密度最高区域，再在高倍镜下选取3个密度较多视野进行微血管计数并取平均值，计算出单位面积微血管数目 （microvascular density,MVD）（个/mm2）。

1.3.3 应激与炎性产物检测

选取部分皮瓣组织称重后用超声匀浆机制成10%匀浆液，于4℃下10 000 r/min离心20 min后取上清液，按照试剂盒说明书步骤进行操作，采用比色法检测皮瓣组织中SOD活性和MDA含量。术后第7 d于皮瓣蒂部抽取腹壁浅动脉血液1.5 ml，4 000 r/min条件下离心15 min分离血清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的光密度（optical density,OD）值，根据标准曲线计算各组大鼠血清中TNF-α和IL-6含量。

1.3.4 VEGF-A和HIF-1α的mRNA检测

取各组大鼠皮瓣组织在冰上匀浆器中剪碎，加入Trizol研磨混匀提取样本总RNA，紫外分光光度计测定各样本总RNA浓度。取2 μg总RNA采用逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。反应体系为：cDNA 2 μl，引物上下游各0.4 μl，REALSYBR Mixture （×2） 10 μl，水 7.2 μl；反应条件为：95℃预变性15 s，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸32 s，40个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算VEGF-A和HIF-1α的mRNA相对表达量。

1.3.5 VEGF-A和HIF-1α的蛋白表达水平检测

取各组大鼠皮瓣组织剪碎匀浆，加入RIPA裂解液提取总蛋白，采用BCA法测定样品浓度，取等量蛋白进行凝胶电泳分离后，转印至PVDF膜上。用脱脂奶粉封闭1 h后，4℃孵育稀释后的一抗（VEGFA、HIF-1α和GAPDH，1:1 000）12 h。次日清洗后加入相应二抗孵育2 h。洗涤后，加入显影液显影成像。使用GAPDH抗体进行内参校正，曝光图像用Image J软件对条带灰度值进行分析，用目的蛋白与GAPDH灰度值比表示目的蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大体观察

术后第1 d，除假手术组外，其余各组皮瓣均出现不同程度的肿胀，皮瓣远端颜色变青；术后第3 d，皮瓣坏死与成活区域开始出现，远段出现面积不等的暗黑色坏死区，坏死部分颜色多为红褐色伴有瘀血；术后第7 d，皮瓣中远端坏死部分趋于融合，有黑色痂壳出现，皮瓣远段不同面积坏死痂壳形成，成活与坏死区界限清楚。模型组和LL-37低剂量组皮瓣中远端及远端颜色发黑，表面有痂壳形成，无弹性，针刺无出血不易剥离，肉膜下炎性分泌物较多；LL-37中剂量组和LL-37高剂量组皮瓣远端颜色发黑，表面有痂壳，无弹性。中远端颜色淡红，表面无痂壳形成，弹性较好，针刺皮瓣出血较多，肉膜下炎性分泌物少。皮瓣存活率如图1所示，与假手术组比较，模型组大鼠皮瓣成活率显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，LL-37的作用呈剂量依赖型改变，中剂量组和LL-37高剂量组皮瓣成活率均显著增加，差异具有统计学意义（P<0.05），LL-37低剂量组无显著变化，差异无统计学意义（P>0.05）。

图1 5组动物皮瓣成活率比较 A:假手术组；B:模型组；C:LL-37低剂量组；D:中剂量组；E:高剂量组，与假手术组比较**P<0.001，与模型组比较##P<0.001

2.2 组织学观察与计量

组织学观察如图2所示，假手术组大鼠皮瓣组织结构正常，纤维组织排列整齐，血管通畅，未见结缔组织水肿和炎性细胞浸润；模型组皮瓣组织结构破坏，可见毛细血管增生，结缔组织明显水肿伴有大量炎性细胞浸润；LL-37低剂量组皮瓣组织结构破坏也较为严重，水肿明显伴有炎性细胞浸润；LL-37中剂量组皮瓣组织结构恢复，轻微水肿伴有部分炎性细胞浸润；LL-37高剂量组皮瓣组织结构较为完整，可见完整毛细血管，未见明显结缔组织水肿和炎性细胞浸润。MVD(（个/mm2）测量结果：假手术组（42.17±3.09），模型组 （15.77±2.40），低剂量组 （17.35±3.08），中剂量组（18.49±2.73），高剂量组（31.05±2.99）。与假手术组比较，模型组大鼠MVD值显著降低（P<0.05）；与模型组比较，LL-37的作用呈剂量依赖型改变，中剂量组和高剂量组MVD值显著增加（P<0.05），低剂量组无显著变化（P>0.05）。

图2 各组大鼠皮瓣组织病理学观察 A:假手术组 B:模型组 C:LL-37低剂量组 D:中剂量组 E高剂量组 2a～2e:皮瓣组织HE染色（×200） 2a:大鼠皮瓣组织结构正常，纤维组织排列整齐 2b:皮瓣组织结构破坏，毛细血管增生，伴有大量炎性细胞浸润 2c:皮瓣组织结构破坏较为严重，伴有较多炎性细胞浸润 2d:皮瓣组织结构恢复，轻微水肿伴有部分炎性细胞浸润 2e:皮瓣组织结构较为完整，基本未见炎性细胞浸润 2f～2j:皮瓣组织CD31免疫组织化学染色观察（×400） 2f:棕黄色部分较多 2g:可见零散的棕黄色部分 2h:可见部分棕黄色部分 2i:可见较多棕黄色部分 2j:可见大量棕黄色部分

2.3 应激与炎性产物检测

检测结果见表1，与假手术组比较，模型组大鼠皮瓣组织中SOD活性显著降低，MDA含量显著增加，TNF-α和IL-6含量显著上升，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，LL-37的作用呈剂量依赖型改变，中剂量组和高剂量组大鼠皮瓣组织中SOD活性显著增加，MDA含量显著降低，TNF-α和IL-6含量显著降低（P<0.05）；低剂量组上述指标变化无统计学意义（P>0.05）。

表1 5组动物应激与炎性产物检测结果（±s）与比较

表1 5组动物应激与炎性产物检测结果（±s）与比较

images/BZ_53_205_885_502_951.pngimages/BZ_53_502_885_819_951.pngimages/BZ_53_819_885_1133_951.pngimages/BZ_53_1133_885_1453_951.pngimages/BZ_53_1453_885_1781_951.pngimages/BZ_53_1781_885_2102_951.pngSOD（U/mg）33.12±2.2018.57±1.3719.05±3.0330.06±2.3937.77±2.18<0.001images/BZ_53_205_752_502_818.pngimages/BZ_53_502_752_819_818.pngimages/BZ_53_819_752_1133_818.pngimages/BZ_53_1133_752_1453_818.pngimages/BZ_53_1453_752_1781_818.pngimages/BZ_53_1781_752_2102_818.pngimages/BZ_53_2102_752_2276_818.pngimages/BZ_53_2102_885_2276_951.pngimages/BZ_53_205_1017_502_1084.pngTNF-α （pg/ml）images/BZ_53_502_1017_819_1084.png44.36±5.05images/BZ_53_819_1017_1133_1084.png177.97±9.11images/BZ_53_1133_1017_1453_1084.png170.06±8.23images/BZ_53_1453_1017_1781_1084.png112.27±6.00images/BZ_53_1781_1017_2102_1084.png89.58±3.30images/BZ_53_2102_1017_2276_1084.png<0.001

2.4 VEGF-A和HIF-1α的mRNA和蛋白检测

各组VEGF-A和HIF-1α的mRNA和蛋白检测结果见表2，与假手术组比较，模型组大鼠皮瓣组织中VEGF-A和HIF-1α的mRNA与蛋白表达水平均显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，LL-37的作用呈剂量依赖型改变，中剂量组和高剂量组大鼠皮瓣组织中VEGF-A和HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平均显著增加（P<0.05），低剂量组变化无统计学意义（P>0.05）。

表2 VEGF-A和HIF-1α的mRNA和蛋白检测结果（±s）与比较

表2 VEGF-A和HIF-1α的mRNA和蛋白检测结果（±s）与比较

images/BZ_53_204_1715_531_1781.pngimages/BZ_53_531_1715_843_1781.pngimages/BZ_53_843_1715_1134_1781.pngimages/BZ_53_1134_1715_1455_1781.pngimages/BZ_53_1455_1715_1776_1781.pngimages/BZ_53_1776_1715_2096_1781.pngVEGF-Aimages/BZ_53_204_1582_531_1649.pngimages/BZ_53_531_1582_843_1649.pngimages/BZ_53_843_1582_1134_1649.pngimages/BZ_53_1134_1582_1455_1649.pngimages/BZ_53_1455_1582_1776_1649.pngimages/BZ_53_1776_1582_2096_1649.pngimages/BZ_53_2096_1582_2276_1649.pngimages/BZ_53_2096_1715_2276_1781.png0.67±0.03 0.50±0.030.26±0.030.48±0.02 0.25±0.03<0.001images/BZ_53_204_1848_531_1914.pngimages/BZ_53_531_1848_843_1914.pngimages/BZ_53_843_1848_1134_1914.pngimages/BZ_53_1134_1848_1455_1914.pngimages/BZ_53_1455_1848_1776_1914.pngimages/BZ_53_1776_1848_2096_1914.pngimages/BZ_53_2096_1848_2276_1914.pngimages/BZ_53_204_1980_531_2047.png蛋白表达水平mRNA表达水平images/BZ_53_531_1980_843_2047.png1.01±0.03images/BZ_53_843_1980_1134_2047.png0.32±0.03images/BZ_53_1134_1980_1455_2047.png0.33±0.04images/BZ_53_1455_1980_1776_2047.png1.32±0.10images/BZ_53_1776_1980_2096_2047.png3.41±0.14images/BZ_53_2096_1980_2276_2047.png<0.001

3 讨论

多项研究显示，LL-37在促进组织损伤修复及诱导血管生成方面具有重要作用［9，10］。Carretero 等［11］研究发现，LL-37在体外可通过诱导皮肤表皮细胞株迁移表型改变，活化黏附相关激酶，促进细胞的迁移能力；而对创面手术后的大鼠给予外源性LL-37干预后，创面肉芽组织形成和上皮再生速度加快。Koc⁃zulla等［12］研究也发现，敲除LL-37基因的大鼠受到创伤后新生血管减少。推测LL-37可能通过促进血管内皮细胞增殖来诱导新生血管形成，说明LL-37介导的血管再生是体内皮肤创伤新生血管形成的重要环节，再次强调了LL-37在创伤修复中的巨大应用潜力。

本研究采用改良“McFarlane flap”法建立大鼠随意皮瓣模型，结果显示，模型组大鼠皮瓣成活率显著低于假手术组，提示模型构建成功。而LL-37中剂量和高剂量干预组的皮瓣成活率较模型组显著增加，同时HE病理染色结果显示，皮瓣组织结构较为完整，皮下组织炎症状况较轻，有新生血管形成，这些均有利于创面愈合［13］，说明LL-37确能提高大鼠背部随意皮瓣的存活率，利于伤后上皮重建。

氧化应激是皮瓣血液供应不足、皮瓣缺血再灌注损伤的重要机制，可通过氧自由基进一步加重组织损伤［14］。组织的炎症反应和损伤修复对移植后的皮瓣存活率影响巨大，减轻组织损伤的炎性反应有利于创伤愈合，促进移植皮瓣成活［15］。本研究结果显示，模型组大鼠皮瓣组织中SOD活性降低，MDA含量增加，同时血清中TNF-α和IL-6含量均显著上升，说明皮瓣组织氧化应激损伤和炎性反应加重，与前人研究一致［16］；而LL-37中剂量和高剂量干预组大鼠血清中TNF-α和IL-6含量及皮瓣组织中MDA含量明显下降，SOD活性增加，说明LL-37具有保护内源性SOD活性、促进自由基清除、抑制术后皮瓣组织炎性应激反应的作用。

VEGF-A能促进血管内皮细胞有丝分裂和增殖分化，加快皮瓣的毛细血管新生速度，是促进皮瓣成活的关键因子［17］。内环境中氧平衡是机体维持稳态的必要条件，当皮瓣缺血发生后，缺氧也会随之而来，HIF-1α是氧稳态主要的调节信号因子，也是影响低氧诱导的血管重建的重要因子，可通过激活下游信号通路，动员内皮细胞进入缺氧和无血管区，刺激内皮细胞增殖，从而实现血管再生［18］。而MVD代表单位面积内微血管数，能反映组织的血管生成活性［19］。刘焕兴等［13］研究发现，移植皮瓣的新生血管形成时，皮瓣组织中VEGF的表达水平和MVD均明显上升。本研究通过免疫组织化学染色检测并计数各组皮瓣MVD，同时检测皮瓣组织中VEGF-A和HIF-1α的表达水平，以评估新生血管情况。研究结果显示，模型组大鼠 MVD、组织中 VEGF-A、HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平均显著降低，而LL-37中剂量和高剂量干预组相关指标均明显上调，说明LL-37能通过促进组织血管新生、改善皮瓣血运、增加皮瓣血管密度，从而提高皮瓣存活率。

综上所述，LL-37能有效刺激新生血管增生，减轻炎症反应，降低氧化应激水平和缺血皮瓣的坏死，促进随意皮瓣的成活，而LL-37的干预效果与剂量相关。