玉米赤霉烯酮液相色谱法的应用与分析

吴宜芬 王小平

（江苏句容市粮食局中心化验室，江苏镇江 212400）

玉米赤霉烯酮是由玉米赤霉菌、禾谷镰刀菌和兰线镰刀菌等真菌所产生的具有雌激素毒性作用的真菌毒素。GB 2761－2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》规定食品中玉米赤霉烯酮限量为60 μg/kg。每年国家粮食和物质储备局都要组织人员对新收获粮食的质量进行监测，这既能为全面了解我国粮食品种质量情况，促进产品优质化发展，科学地调整粮食种植结构，以优质的粮油产品来提高食用安全；又能为贯彻国家粮油质量标准提供科学依据，确保国家粮食安全和严防粮食质量安全风险。

2020 年6 月，江苏省粮食和物资储备局下达了苏粮发［2020］34 号《关于开展专项行动进一步加强粮食质量安全监管的紧急通知》文件要求严把收购入库关口，把小麦中玉米赤霉烯酮列入入库必检项目。在2020 年夏粮入库工作中，句容市粮食局中心化验室承担了国家新收获粮食质量的部分安全监测任务，主要负责小麦玉米赤霉烯酮的检测，共检测小麦样品300 余份，得到了一些用液相色谱法测定玉米赤霉烯酮的经验。

1 测定原理、仪器、试剂与配制

1.1 测定原理

小麦中玉米赤霉烯酮经乙腈水提取、免疫亲和柱净化后，用液相色谱荧光检测器测定。样品溶液中的各组分经过反复多次的吸附—解吸分配过程，被分离成单个组分依次从柱内流出，样品通过检测器时的浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式展现，再经数据处理系统处理，按保留时间定性、外标法定量，从而得到被测组分含量。

1.2 仪器

安捷伦1260 液相色谱，配有FLD 荧光检测器；天平，感量 0.01 g、0.0001 g；试管研磨机、离心机、超声洗涤仪、抽滤装置、200 μL 和1000 μL 移液枪 、直径 11 cm 孔径 1.5 μm 玻璃纤维滤纸、20 mL 注射器、50 mL 聚丙烯刻度离心管、玉米赤霉烯酮免疫亲和柱等。

1.3 试剂的配制

甲醇—水溶液：量取65 mL 甲醇加入到35 mL水中，混匀。

10%异丙酮（介质为水）：吸取1mL 异丙酮用水定容至10 mL。

乙腈—水溶液：量取90 mL 乙腈加入到10 mL水中，混匀。

标准品：玉米赤霉烯酮母液20.52 μg/mL，标准品梯度设置在待测物响应值的标准曲线线性范围内。

2 样品制备

采集2020 年6—8 月句容市新收获粮食和夏粮入库混合小麦样品300 余份。

2.1 样品预处理

2.1.1 去除杂质

杂质是指小麦以外的其他物质，包括筛下物、无机杂质和有机杂质等。首先分取大样1200 g，分4 次筛选，每次约300g，捡出筛上大型杂质并弃除下层筛下物，合并上下层筛上的粮食籽粒测定容重，然后再进行分样，部分样品留作水分和不完善粒测定，部分样品按质量标准规定捡出所有杂质后作为净小麦留作粉碎。

2.1.2 粉碎

取不少于500 g 的样品，用试管研磨机将其粉碎（细度通过40 目），混合均匀后缩分至100 g，储存于样品瓶中，密封保存，供玉米赤霉烯酮提取用。

2.2 检测方法

水分按GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》执行。

容重按GB/T 5498—2013《粮食检验 容重》执行。

不完善粒按GB/T 5494—2019《粮食检验 粮食、油料的杂质、不完善粒检验》执行。

玉米赤霉烯酮按GB 5009.209—2016《食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定》液相色谱法执行。

3 测定步骤

3.1 样品的提取净化

3.1.1 样品提取步骤

称取 40 g（准确到 0.1 g）磨碎试样于250 mL具塞三角瓶中→加入4 g 氯化钠→加乙腈水100 mL混匀→振荡或涡旋 15 min→提取液倒入试管中离心10 min（6000 r/min）或过滤；准确吸取滤液10 mL于100 mL 玻璃试管中再加入40 mL 纯水混匀→用玻璃纤维滤纸过滤于50 mL 洁净试管中备用。

3.1.2 样品净化步骤

（1）连接洗脱：泵操作→将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温→弃去免疫亲和柱内原有液体→剪去螺纹突出部分→针筒装连接亲和柱放在样品架上→准确移取上述滤液10 mL→开泵（根据液体流速调节泵的开关）→样液以1 滴/s 流速通过亲和柱。

（2）纯水淋洗：分2 次吸取纯水各10 mL→以2滴/s 流速通过亲和柱→淋洗结束取下针筒和亲和柱→再用原链接针筒排空水分。

（3）甲醇淋洗：将用纯水淋洗过的亲和柱放入小试管架→注入2.0 mL 色谱纯甲醇于亲和柱中（以自然重力下滴）→净化样液直接进液相小瓶→净化样液上机待测。

3.2 液相色谱仪的操作条件

色谱柱，C18 柱、柱长 150 mm×4.6、粒度 4 μm；流动相，V甲醇∶V水=65∶35；流速，1.0 mL/min；柱温，35 ℃；进样量，20 μL；激发波长，274 nm；样品采集时间，11 min。

3.3 测定步骤

3.3.1 软件操作

先管冲洗：开启仪器状态准备就绪后，用四元泵右击方法扭松排液阀，改流量5.000，A 管应用（约2 min 气泡排完）；B 管输100 应用，气泡排空后改0；C 管、D 管依次冲洗；再进行柱冲洗，改流量1.000，改B 管65（甲醇水为流动相）应用，关排液阀，冲洗20 min。

3.3.2 样品盘设置（P1 盘和P2 盘可随意放置）

如采用 P1 盘，可以 P1a1 空白；P1a2 至 P1a7 校正标准；P1a8 样品依次排列。

3.3.3 样品检测

在线信号选择FLD，基线走平后点击运行；样品自动检测。

3.3.4 数据处理

数据选择关联全部；打开测试的所有标样和样品，选用GC/CC 定量，调用前处理，方法另存输文件名保存；看色谱图：根据被测物出峰时间删去多余杂峰，应用空白扣除，所有进样使用指定空白；点击色谱图中的留用峰，峰作为化合物添加到方法；输入有关信息，点重新处理全部。结果见表1。

表1 部分小麦样品玉米赤霉烯酮检测结果

4 监控结果有效性

应用GB 5009.209—2016 中的液相色谱法测定谷物中玉米赤霉烯酮含量，为确保检测结果的准确性和可靠性，对检测过程的各个环节需进行有效控制，以确保仪器的性能及整个检测工作质量能满足实验要求。

4.1 加标回收

用液相色谱法测定玉米赤霉烯酮的样品前处理比较复杂，稍有操作不当就会导致样品含量损失或污染，因此加标回收是最好的验证方法。通过回收率可找出实验中各环节存在的问题，控制实验误差，达到检测人员能提供可靠数据的要求。表2 为加标回收验证结果。

表2 加标回收验证结果

从表2 可以看出，空白加标、试样加标、样品洗脱液加标均符合GB/T 27404—2008 附录F 规定的回收率范围（80.0%～110.0%），说明液相色谱法测定玉米赤霉烯酮操作技术水平符合规范要求。

4.2 质量控制样品验证

质量控制样品验证对检测结果的准确性、精密性起着关键作用。在实验中购置已知浓度样品，将与试验样品在相同条件下测试，验证其质量控制样品的实际检测数据与给定的检测数据是否一致（误差在允许范围），以判断这次检测过程的准确性和样品数据的可信度。表3 是本次研究的质量控制样品检测结果。

从表3 中可以看出，质量控制样品再测数据在可控范围内，符合GB 5009.209 重复条件下两次独立测定结果绝对差值不超过算术平均值15 %的规定要求，验证了液相色谱法测定玉米赤霉烯酮操作正确、技术过关、数据可靠。

表3 质量控制样品验证结果

5 应用与分析

5.1 脱气处理采用流动相，以提高检测灵敏度

流动相使用前必须进行脱气处理，除去其中溶解的气体，以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析；溶解的氧气还会导致样品中某些组分被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。

5.2 选择合适标准曲线梯度，以取得标准品良好线性

选用合适的标准梯度，保证样液中待测物的响应值应在标准曲线线性范围内，使校正曲线相关系数达0.999 以上，确保样品检测结果的科学性、准确性。

5.3 采用适当溶液比例流动相，以获得较好峰形

改善峰形是提高灵敏度和定量分析精确度的目的。在实际检测过程中，需要根据实验室条件和具体情况调整流动相的配比，样品的出峰时间和峰形与流动相的极性有很大关系，峰的保留时间6～15 min 为宜；色谱峰区域宽度是反应色谱分离条件好坏的重要参数，要使其达到峰高的0.607 处的要求。

5.4 进行监控结果有效性控制，以检测工作质量

为确保检测数据的稳定性、准确性和科学性，使检检工作有序、有效进行，在检测工作过程中必须对各个环节进行监控结果有效性控制。加标回收和开展质量控制样品验证是确保检测工作质量的具体措施，是衡量检测人员业务技术水平的有效手段。只有选用得当的检测方法，准确掌握仪器的使用性能，检测人员才能熟能生巧。同时实验环境能满足仪器运行条件，对监控结果能实施有效性控制，才能确保玉米赤霉烯酮液相色谱法的准确性和可靠性。