高通量测序多SNP单体型连锁分析技术诊断罗氏易位患者正常胚胎的临床应用

王喜良，伍昌胜，郝冬梅，张金艳，檀畅，费嘉，于月新*

(1.中国人民解放军北部战区总医院生殖医学科，沈阳 110003；2.北京嘉宝仁和医疗科技有限公司，北京 102629)

罗氏易位是人类中较常见的一类染色体结构畸变。罗氏易位携带者夫妇在生育时可能面临反复流产或出生先天缺陷患儿风险。染色体非整倍体筛查技术只能排除染色体不平衡胚胎，不能区分染色体正常胚胎和罗氏易位携带胚胎。高通量测序多SNP单体型连锁分析技术可以区分胚胎是否携带亲代的异常染色体，从而诊断出染色体正常的胚胎，帮助患者出生染色体正常的婴儿。本研究对5对罗氏易位携带者夫妇实施了高通量测序多SNP单体型连锁分析技术，鉴别出染色体正常胚胎并移植，出生了4个染色体正常婴儿，现报道如下。

资料与方法

一、研究对象及材料

1.研究对象：2018～2020年因不孕症或不良妊娠史就诊于北部战区总医院生殖医学科，常规核型分析发现一方染色体为罗氏易位而行胚胎植入前遗传性检测的患者共30例，其中5对夫妇采用高通量测序多SNP单体型连锁分析技术区分罗氏易位携带和正常胚胎。患者均签署知情同意书。

2.主要试剂及耗材：胚胎培养液(Cooper Surgical SAGE Media，CooperSurgical，美国)；胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒、胚胎染色体异倍体分析系统(北京中仪康卫医疗器械)；血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技)；胚胎植入前单基因病检测建库试剂盒(北京中仪康卫医疗器械)。

二、研究方法

1.促排卵、授精及胚胎活检：采用长方案、改良长方案、拮抗剂方案或高孕激素状态下促排卵(PPOS)方案促排卵；获得的成熟卵母细胞采用卵胞浆内单精子注射(ICSI)方式授精；对培养得到的囊胚活检5～10个滋养层细胞，活检后的胚胎采用玻璃化方法进行冻存。

2.胚胎植入前非整倍体检测(PGT-A)：对活检的滋养层细胞采用PGT-A试剂盒进行全基因组扩增和文库构建，使用MiSeqDx测序仪进行测序，测序数据使用胚胎染色体异倍体分析系统软件对染色体拷贝数进行分析。分析方法：测序数据经过质控后，比对到人类参考基因组上，将整个参考基因组分为若干窗口并计算窗口的reads数，然后通过数据校正，结合参考数据集确立的参考范围使用生物信息学算法进行拷贝数分析。检测分辨率为4 Mb。

3.胚胎染色体结构鉴定(PGT-SR)：从近端着丝粒染色体的着丝粒附近3 Mb或5 Mb区域(长臂端)内筛选有效的高频SNP位点作为标记，对父母和易位染色体PGT-A检测结果异常的胚胎(作为参照)进行连锁分析，分别构建易位染色体的断裂点附近区域的单体型；再利用构建好的单体型判断PGT-A结果正常的胚胎的衍生染色体携带状态(即正常或携带者)。具体操作：以父母外周血DNA和胚胎细胞全基因组扩增产物为模板，对目标区域进行多重 PCR扩增；使用胚胎植入前单基因病检测建库试剂盒对多重PCR扩增产物进行文库构建和MiSeqDx 测序；然后利用生物信息方法选择该家系中多个有效位点建立连锁关系。通过2个以上的有效位点的连锁关系构建单体型。

4.胚胎移植及产前诊断：采用人工周期准备内膜，选择染色体正常胚胎行复苏移植。移植后第14天检测血HCG水平，移植后第28天B超观察孕囊，妊娠16～18周抽取羊水进行产前诊断。

三、数据处理分析

本研究采用描述性统计。

结 果

一、患者基本资料

5对患者夫妇编号为R1～R5。女方平均年龄28.4岁，主诉包括不良妊娠史后不孕、多年原发不孕和复发流产史。罗氏易位携带者核型分别为45，XY，rob(13；14)(q10；q10)、rob(14；15)(q10；q10)和45，XX，rob(13；14)(q10；q10)(表1)。

表1 患者夫妇基本资料

二、患者促排卵周期及胚胎发育情况

5对患者夫妇共促排卵7个周期，采用的促排卵方案包括长方案、改良长方案、拮抗剂方案和PPOS方案。共获卵200个，平均每周期获卵28.6个。共获得成熟卵母细胞176个，平均每周期25.1个，卵母细胞成熟率为88.0%。正常受精数合计140个，平均每周期20个，正常受精率为79.5%。正常卵裂胚合计138个，平均每周期19.7个，正常卵裂率为98.6%。共获得可用囊胚76个，平均每周期10.9个，可用囊胚生成率为55.1%(表2)。

表2 患者促排卵及胚胎发育情况

三、取卵周期胚胎非整倍体检测及染色体正常胚胎情况

PGT-A共检测50个胚胎，其中整倍体胚胎24个，整倍体胚胎比例为48.0%。24个整倍体胚胎中，经多SNP单体型连锁分析技术诊断，染色体正常胚胎13个，染色体正常胚胎占整倍体胚胎比例为54.2%(表3)。

表3 胚胎非整倍体检测及染色体正常胚胎情况

5对夫妇的7个周期均获得染色体正常胚胎。其中，R4-2周期胚胎的PGT-A和PGT-SR结果显示：胚胎R4-2-01和R4-2-03均为整倍体胚胎，但胚胎R4-2-01单体型与易位携带者单体型一致，推断为易位携带者胚胎；胚胎R4-2-03单体型与正常单体型一致，推断为正常胚胎(图1，表4)。

A：罗氏易位携带者胚胎(R4-2-01)；B：正常胚胎(R4-2-03)图1 罗氏易位携带者(编号R4)PGT-A结果

表4 罗氏易位携带者(编号R4)的胚胎单体型分型结果

四、复苏周期胚胎移植(FET)临床结局

复苏移植9个周期，移植9个染色体正常胚胎。临床妊娠6个周期，早期流产1个周期；出生4个染色体正常婴儿，另有1例继续妊娠中，预期可以正常活产(表5)。

表5 胚胎复苏移植后临床结局

讨 论

人类有23对46条染色体，染色体的数量、结构相对恒定。不同源的染色体各自发生断裂后，互相变位重接而形成结构上重排的染色体称相互易位。罗氏易位是一种特殊类型的相互易位，是两个具有近端着丝粒的染色体(第13、14、15、21、22号染色体)于着丝点附近断裂，两条染色体长臂重接成为易位染色体，短臂丢失，因而罗氏易位携带者只有45条染色体。罗氏易位是人类中较常见的一类染色体结构畸变，在人群中发生率约为1.23/1 000[1]。

罗氏易位基本保留了原有基因总数，对基因作用和个体发育无严重影响，因此罗氏易位携带者本身无表型异常，然而携带者在形成生殖细胞时可产生6种类型的配子：1种为染色体正常、1种为罗氏易位携带、4种为染色体不平衡。由此可产生3种胚胎类型，不同的胚胎类型有不同的生育风险。第一种是完全正常胚胎(1/6)：正常妊娠，后代无罗氏易位携带风险；第二种是罗氏易位携带胚胎(1/6)：正常妊娠，后代同样面临流产、反复流产或出生先天缺陷患儿风险；第三种是染色体不平衡胚胎(4/6)：导致患者自身流产、反复流产或先天缺陷患儿出生，如13-三体综合征患儿、21-三体综合征患儿等。

随着辅助生殖技术的发展，出现了胚胎植入前遗传学检测技术(PGT)，该技术可以在胚胎着床前筛查胚胎染色体非整倍体，从而排除染色体不平衡的胚胎，避免患者不良妊娠的发生。罗氏易位的常见PGT检测技术有荧光原位杂交(FISH)、微阵列比较基因组杂交(array CGH)、单核苷酸多态性芯片(SNP array)和高通量测序技术(NGS)等。FISH、SNP array、array CGH、NGS均可以诊断胚胎的非整倍性，但FISH受探针数量的限制仅能检测少数特定染色体的数目异常，不能检测所有染色体的异常[2]。SNP array和array CGH作为芯片检测技术，可以检测整个染色体组的拷贝数异常，但一款芯片的拷贝数变异(CNV)检测分辨率是固定的，灵活性受限。NGS技术能检测所有染色体的拷贝数异常，并且检测分辨率可以通过调整测序深度而进行调整。比如，测序深度为0.01～0.1 X时，检测分辨率可达4 Mb；测序深度提高到约0.25 X时，分辨率可达到1 Mb。

目前常用技术如FISH、array CGH、SNP array等[3-5]，通过检测胚胎染色体非整倍体，选择整倍体胚胎(即平衡型胚胎，包括易位携带胚胎和完全正常胚胎)进行植入，帮助患者获得一个活产的健康孩子，但仍可能将异常(易位)染色体传递给子代，不但会导致子代面临生育问题，对患者本身也是一个长期的心理负担。因此对平衡型胚胎进一步区分为易位携带胚胎和正常胚胎具有重要临床意义。NGS技术结合SNP单体型连锁分析技术，既能实现对罗氏易位平衡型胚胎的检出[6-9]，也能对易位携带胚胎和正常胚胎进行区分[10-13]，避免了异常染色体携带患儿的出生。有学者分别通过ION PGM测序平台实现了对1个家系罗氏易位胚胎易位携带状态的分析，但ION PGM测序平台由于数据量较低以及对连续相同碱基测序准确性较低等不足，实际应用受限[10，13]。陈雯等[12]使用等位基因映射识别技术对罗氏易位胚胎也实现了胚胎易位状态的判断，但使用断裂点上下游1 Mb范围内选择SNP位点，可能会因连锁分析缺乏有效SNP位点而导致胚胎检测失败。高通量测序多SNP单体型连锁分析技术，采用测序准确性更高的MiSeqDx平台测序，连锁分析选择SNP位点时选取近端着丝粒染色体的着丝粒附近高达3 Mb或5 Mb区域内筛选有效的高频SNP位点，可以区分胚胎是否携带亲代的异常染色体，从而诊断出染色体正常的胚胎，帮助患者出生染色体正常的婴儿。

本研究采用高通量测序多SNP单体型连锁分析技术对5对罗氏易位携带者夫妇(其中4对为男性罗氏易位携带)的胚胎进行了诊断。相关数据为：(1)染色体正常胚胎占整倍体胚胎比例为54.2%，整倍体胚胎占检测胚胎的比例为48.0%，大致上4个囊胚可以得到一个染色体正常的整倍体胚胎；(2)可用囊胚生成率为55.1%，生成4个囊胚大致上需要8个卵裂期胚胎；(3)正常卵裂率为98.6%，正常受精率为79.6%，卵母细胞成熟率为88.0%，8个卵裂胚胎大致上需要11.6个卵母细胞；(4)移植周期活产率为55.6%(5/9)。因此最终推算下来，患者要获得一个活产胎儿，需要的卵母细胞数为21.6个。国内患者每个取卵周期平均获卵数为10～12个[14-15]，因此罗氏易位携带者要获得一个染色体正常胎儿，平均需要取卵2个周期。本研究5对夫妇中，女方均较年轻(平均年龄为28.4岁)，因此3对夫妇仅一次取卵即获得了染色体正常胚胎并移植成功，并获得活产婴儿；第4对夫妇第1周期获得了两个染色体正常胚胎，但因为移植后早期流产和未妊娠，而进行了第2个周期的治疗；第5对夫妇第1周期获得了1个染色体正常胎儿，但移植后未妊娠，而进行了第2周期的治疗。

有报道女性罗氏易位携带者平衡型胚胎发生率较男性携带者低[6]，异常胚胎发生率更高[7]，可能与女性携带者更难形成对位分离型配子(正常或易位携带者)[16]以及与染色体间相互效应(interchromosomal effect)[17-18]相关。因此女性罗氏易位携带者进行 PGT 治疗可能需要更多的卵母细胞和治疗周期。本研究中仅1例患者为女性罗氏易位携带者，未发现该现象。

综上所述，高通量测序多SNP单体型连锁分析技术可以区分胚胎染色体携带或不携带亲代的异常染色体，从而诊断出染色体正常的胚胎，帮助患者出生染色体正常的婴儿，对患者及其家庭具有非常重大的意义。本研究从临床实践中总结了高通量测序多SNP单体型连锁分析技术诊断罗氏易位患者正常胚胎治疗过程的相关数据，对临床医生的决策和患者的知情选择具有一定的参考价值。