痔断根片治疗痔疮的药效学实验研究及对结肠黏膜组织AQP1表达的影响

赵 平，黄 华，丁旭枫，卫 军，蒋 捷，季利江

痔疮是肛肠科常见病和多发病，发病率约占肛肠疾病50%[1-2]。由于不规律的生活作息、不良的饮食习惯，痔疮发病率逐年上增，严重地影响着人们的健康和生活质量[3]。

痔断根片是常熟市中医医院多年治疗痔疮的经验用药，治疗风伤肠络、湿热下注证痔病，能够极大改善内痔患者症状，起到促进止血、缓解疼痛、促进痔黏膜修复等作用，对内痔治疗效果尤其显著[4]。前期研究表明，痔断根片相较于地奥司明片内痔患者出血、疼痛、坠胀感的临床症状明显减少，且能显著减少患者痔核脱出、减小痔核体积[4-5]。已有研究表明，痔断根片对痔疮治疗有显著的临床效果，但其相关的药效学研究仍未有报道，阻碍了痔断根片的进一步推广及应用。本研究通过各病理模型小鼠探究了痔断根片在抗炎、镇痛、止血和促进肠蠕动的作用，总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 阿司匹林肠溶片，购自拜耳医药保健有限公司，批号：BJ27286；洛派丁胺盐酸盐，Sigma‑aldrich公司，货号：L4752；乳果糖口服溶液（杜密克），购自Abbott Biologicals B.V.(荷兰)；二甲苯，购自南京化学试剂厂，批号：010920；乙酸，购自南京化学试剂股份有限公司，批号：150923844E；SPF 级 ICR 小鼠共240只，体质重18~22 g，雌雄各半，购自扬州大学，动物生产许可证号：SCXK(苏)2017‑0001，实验动物合格证号：NO.201807019；小鼠饲养于清洁动物实验房，采用架式笼养，环境温度24~26 ℃，相对湿度50%~60%；紫外分光光度计，购自上海仪器科技有限公司，型号：UV‑1100；电子天平，购自德国赛多利斯集团，型号:BSA124S‑CW;实时荧光定量PCR仪，购自美国Bio‑rad，型号：CFX96。

1.2 方法

1.2.1 痔断根片制备 痔断根片混悬液：南京中医药大学常熟附属医院肛肠科制备，采用的药材均从先声再康江苏药业有限公司（南京学衡路药店）购买。取黄连45 g，黄芩45 g，当归45 g，地榆炭 45 g，火麻仁75 g，生地75 g，防风 45 g，龟板15 g，珍珠粉 20 g，加入10倍量水，煎煮1 h后过滤，并浓缩滤液小于500 mL；再加入经粉碎并过200目筛的荆芥炭4 500 g，生大黄45 g，槐米炭75 g，制得浓度为0.72 g生药/mL的痔断根片混悬液，分装‑20 ℃保存，待用。

1.2.2 抗炎实验 取ICR小鼠50只，雌雄各半，随机平均分为5 组，分组与处理如下：①模型对照组：生理盐水20 mL/kg；②阳性对照组:阿司匹林0.05 g/kg；③痔断根片低剂量组：1.8 g 生药/kg；④痔断根片中剂量组：3.6 g生药/kg；⑤痔断根片高剂量组：7.2 g生药/kg。各组小鼠每天用药物灌胃1次，连续3 d。末次给药1 h 后，在小鼠右耳两侧涂抹0.10 mL 二甲苯。涂药1 h后，处死小鼠并切断左右耳。用打孔器在两耳同一部位取出圆状耳片，再用电子天平计算两个耳片的重量，比较各组耳壳肿胀程度（右耳片重量－左耳片重量），计算各组小鼠肿胀抑制率：肿胀抑制百分率（%）=（给药组小鼠耳壳肿胀度/模型对照组小鼠耳壳肿胀度）×100%。

1.2.3 镇痛实验 取ICR 小鼠50 只随机分为5 组，分组与处理同1.2.2。各组末次给药1 h后，用0.5%乙酸注射入腹腔。30 min后，观察各组小鼠出现扭体反应的数量以及次数，实验结束后处死。

1.2.4 促排便实验 取ICR小鼠60只，雌雄各半，随机平均分为6组，分组与处理如下：①空白对照组：生理盐水10 mL/kg；②模型对照组：生理盐水10 mL/kg；③阳性对照组：乳果糖口服溶液，5.0 mL/kg；④痔断根片低剂量组：1.8 g生药/kg；⑤痔断根片中剂量组：3.6 g生药/kg；⑥痔断根片高剂量组：7.2 g生药/kg。除阳性对照组外，各组每日灌胃给药1次，连续3 d，阳性对照组于洛派丁胺给药1 h前给予乳果糖口服溶液。末次给药1 h后，空白对照组灌胃给予冷开水10 mL/kg，其余组灌胃给与洛派丁胺5 mg/kg（0.05%CMC‑Na 配制，0.5 mg/kg）构建小鼠便秘模型，同时所有组别给与0.1 mL印度墨汁，观察首粒黑便时间及5 h内的黑便数目。另外在造模给药前，收集各组新鲜粪便2~5粒，测定粪便含水量。含水量计算公式：含水量=（湿粪—干粪）/湿粪×100%

1.2.5 qRT‑PCR 检测结肠黏膜组织水通道蛋白1（aquaporin1，AQP1）mRNA 表达 将用于促排便实验的各组小鼠脱颈处死。取结肠黏膜组织约100 mg，加入裂解液，并用匀浆机破碎，提取总RNA。以 β‑actin 作为内标，采用 qRT‑PCR 检测AQP1 在结肠黏膜组织中的表达水平。引物AQP1正义链为 5′‑GGAGATGAAGCCCAAATAGAG‑3′，反义链为 5′‑GCTCTGAGACCAGGAAACAGA‑3′;β-actin 正义链 5′‑GGGACCTGACTGACTACCTC‑3′，反义链 5′‑TCATACTCCTGCTTGCTGAT‑3′。

1.2.6 止血、凝血实验 取ICR 小鼠40 只，雌雄各半，随机平均分为4 组，分组与处理如下：①空白对照组：生理盐水20 mL/kg；②痔断根片低剂量组：1.8 g 生药/kg；③痔断根片中剂量组：3.6 g 生药/kg；④痔断根片高剂量组：7.2 g 生药/kg。各组小鼠每天用药物灌胃1 次，连续3 d。末次给药1 h 后，将小鼠尾尖切下约3 mm，计算出血时间。每隔3 s 用滤纸轻轻触碰伤口，直到伤口没有血液渗出的时间为小鼠出血时间。取ICR 小鼠40 只，雌雄各半，随机平均分为4 组，分组和给药方式同上，末次给药后，采用眼科镊取血，取第2 滴血置于干净的玻璃片上，隔3 s观察血滴是否有血丝，观察到有血丝出现的时间作为凝血时间。

1.3 统计学处理 应用SPSS 21.0 软件，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痔断根片对小鼠耳肿胀的影响 痔断根片高、中、低剂量组的耳廓肿胀程度比模型对照组显著减轻（P<0.05或P<0.01）；肿胀抑制率随着痔断根片用药量的增加而增加，低、中剂量组的肿胀抑制率比阳性对照组低，但差异不显著；痔断根片大剂量对小鼠耳廓肿胀的抑制程度优于阿司匹林。

2.2 痔断根片对小鼠疼痛的影响 与表1模型对照组相比，由乙酸引起的小鼠扭体反应在痔断根片高、中剂量组显著减少（P<0.05 或P<0.01）；与阳性对照组比较，痔断根片高剂量组小鼠的扭体反应次数也能明显降低（P<0.05），表明痔断根片可以减轻乙酸引起的小鼠疼痛反应，有一定的镇痛效果，表2。

表1 痔断根片对小鼠耳肿胀的影响()

表1 痔断根片对小鼠耳肿胀的影响()

与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组比较，#P<0.05

组别 耳壳重量（mg）左18.4±0.8 18.5±0.7 18.6±0.9 18.5±0.8 17.9±0.8右模型对照组阳性对照组痔断根片低剂量组痔断根片中剂量组痔断根片高剂量组35.0±4.9 31.6±1.4 35.6±1.1 34.8±1.3 27.8±2.6肿胀程度（mg）16.6±5.0 13.2±1.5*17.0±1.4*16.3±1.1*9.9±2.3**，#肿胀抑制率（%）...29.7 8.9 13.0 47.2

表2 痔断根片对小鼠疼痛的影响()

表2 痔断根片对小鼠疼痛的影响()

与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组比较#P<0.05

抑制率（%）...26.8 8.56 14.6 43.7组别模型对照组阳性对照组痔断根片低剂量组痔断根片中剂量组痔断根片高剂量组无扭体反应动物数（只）0 1 0 0 2给药后15 min内扭体反应次数32.2±6.5 23.6±5.7**29.4±5.0 27.5±5.3*18.1±5.1**，#

2.3 痔断根片对便秘小鼠排便时间和粪便含水量的影响 模型对照组小鼠首粒黑便的出现时间比空白对照组明显延长（P<0.01），5 h 内的黑便粒数与粪便含水量明显降低（P<0.01），表明洛派丁胺引起小鼠便秘。与模型对照组比较，阳性对照组、痔断根片高剂量组可以显著缩短首粒黑便出现的时间（P<0.05 或P<0.01），增加 5h 内黑便粒数和粪便含水量（P<0.05或P<0.01），提示痔断根片有一定程度的通便、润肠作用，且高剂量痔断根片效果优于乳果糖口服溶液，表3。

表3 痔断根片对首粒黑便时间、5 h内黑便粒数和粪便含水量的影响()

表3 痔断根片对首粒黑便时间、5 h内黑便粒数和粪便含水量的影响()

与空白对照组比较，##P<0.05；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别空白对照组模型对照组阳性对照组痔断根片低剂量组痔断根片中剂量组痔断根片高剂量组首粒黑便时间（min）130.0±33.8 268.2±60.1##223.7±41.8*264.4±59.9 243.6±41.7 183.2±44.1**5 h黑便粒数12.5±3.1 2.0±0.9##5.7±1.8**2.1±0.9 3.4±0.84*7.9±2.0**粪便含水量53.9±2.6 30.5±1.3##54.5±2.0**46.6±3.5 56.9±4.4 59.3±2.7**

2.4 痔断根片对结肠黏膜组织AQP1 mRNA 表达的影响 与空白对照组比较，模型对照组小鼠结肠黏膜组织AQP4 mRNA 表达显著升高（P<0.01），表明洛派丁胺可以通过调控AQP1 表达引起小鼠便秘。与模型对照组比较，阳性对照组、痔断根片低剂量组、痔断根片中剂量组和痔断根片高剂量组均可下调AQP1 表达（P<0.05 或P<0.01），且高剂量痔断根片调控AQP1的效果优于乳果糖口服溶液，表4。

表4 痔断根片对结肠黏膜组织AQP1 mRNA表达的影响()

表4 痔断根片对结肠黏膜组织AQP1 mRNA表达的影响()

与空白对照组比较，##P<0.05；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别空白对照组模型对照组阳性对照组痔断根片低剂量组痔断根片中剂量组痔断根片高剂量组AQP4 mRNA相对表达量1.00±0.06 12.20±0.05##1.91±0.06**8.35±0.07*5.76±0.09*1.24±0.05**

2.5 痔断根片对止血及凝血时间的影响 连续3 d给予小鼠不同剂量痔断根片后，与空白对照组比较，痔断根片高、中剂量组的小鼠止血时间和凝血时间明显缩短（P<0.05），提示痔断根片有一定的止血作用，表5。

表5 痔断根片对小鼠止血时间及凝血时间的影响()

与空白对照组比较，*P<0.05

组别空白对照组痔断根片低剂量组痔断根片中剂量组痔断根片高剂量组止血时间（s）294.5±30.6 286.7±46.1 270.9±33.3*252.2±37.6*凝血时间（s）145.3±22.8 146.0±21.2 130.6±17.7*111.2±21.8*

3 讨论

痔疮是一类多发病，严重地影响着人们的健康和生活质量[6-7]。痔疮多为饮食不节，起居失慎，湿热内生，蕴结肠道，下注肛门或风伤肠洛，热迫血下致[8]。中医药治疗疾病的特点就是运用辨证论治，从多方面多角度改善患者的症状和体征，符合痔疮疾病发病原因和治疗原理[9]。

南京中医药大学常熟附属医院肛肠科在临床治疗内痔常用的中药制剂基础上，研制出了痔断根片，旨在寻找到一种稳定、易用、有效、安全的促进肛瘘创面愈合的有效制剂，并在临床推广应用。痔痔断根片充分利用了药物功能的适当兼容性，能达到显著的治愈效果[4-5]。痔断根片由槐米炭、当归、黄连、生地、黄芩、大黄、火麻仁等十余味中药组成，经煎煮浓缩,烘干后研末,压制成片。槐米炭药性阴寒沉降，善止痔血，配合黄连、生地、黄芩等能入血从而起到止血作用[4，10-11]。当归和火麻仁可以起到润滑肠道、促进排便的作用，大黄素用于湿热导致的便秘症状，3 类药合理配伍让痔断根片的效果十分突出[12-14]。将大便软化、促进排便通畅，是治疗痔疮的重要手段[15]，而痔断根片恰能软化大便，使痔疮患者的症状有效消减。

本研究采用了小鼠各类病理模型，证实了痔断根片的抗炎、镇痛、止血及通便润肠功效，与先前报道的痔断根片治疗痔疮的治疗临床疗效取得一致[4]。基于各类小鼠模型，本研究发现高剂量痔断根片的抗炎镇痛效果优于阿司匹林、润肠通便作用优于乳果糖。近年研究发现水通道蛋白异常表达与便秘存在显著相关性，而便秘极易引起痔疮反复发作[16]。结肠黏膜组织中AQP1表达量升高往往导致黏膜吸收水分过度，从而造成粪便含水量急剧下降，诱发便秘[17-18]。本研究发现痔断根片可有效降低AQP1 表达，从而使粪便含水量升高达到促进排便作用，在一定程度上保存肠道内水分，这可能是痔断根片在临床应用上有效改善痔核脱出的原因之一。痔断根片能通过调控AQP1 表达量改善小鼠排便情况，这提示痔断根片或许是便秘引起痔疮反复发作的有效预防用药。

本研究利用小鼠耳肿胀急性炎症模型、乙酸刺激构建的疼痛模型、洛派丁胺诱导的便秘模型、出血及凝血模型，充分研究了痔断根片的药效，实验表明痔断根片具有抗炎、镇痛、通便润肠和止血功效，为痔断根片的深入开发和临床应用提供了扎实的基础。