苍耳子治疗过敏性鼻炎的分子机制研究

王 康，孟 泳，王玉洁，季绍威，邓泽坤

过敏性鼻炎（Allergic rhinitis）又称变应性鼻炎，普遍认为其是以IgE 介导的I 型变态反应。临床症状为阵发性喷嚏、清水样涕、鼻塞、鼻痒等，严重影响患者的睡眠及生活质量。据流行病学显示，全球约有10%~40%的人口患有此病[1]。在我国，过敏性鼻炎患病率达10%以上，近几年呈上升趋势[2]。长期的临床观察发现，过敏性鼻炎控制不当，易诱发支气管哮喘。

苍耳子为菊科植物，性味辛、苦、温，具有散风寒、通鼻窍的功效，是治疗鼻鼽的良药，临床应用广泛。在对治疗鼻部疾病的常用方剂统计发现[3]，含有苍耳子的方剂占比约80%。经动物实验证实[4]，含苍耳子正丁醇的滴鼻剂和苍耳油对变应性鼻炎有较好的治疗作用，但其具体作用机制不明。网络药理学是中医药研究的新途径，不但能揭示中药对机体的网络调控，也能为新药的研发提供方向，节约成本[5]。为了更好地阐述苍耳子治疗疾病的分子机制，本研究将借助网络药理学对此进行探讨。

1 材料和方法

1.1 数据库及软件 本研究所涉及的数据库：中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php），有机小分子生物活性数据库（PubChem）（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），在线人类孟德尔遗传数据库（online mendelian inheritance in man, OMIM）（https://omim.org/），基因组注释数据库平台（GeneCards）（https://www.genecards.org/），基因与疾病关联数据库（DisGeNET）（https://www.disgenet.org/），全球蛋白资源数据库（Uniprot）（https://www.uniprot.org/），蛋白质相互作用关系网络数据库（String）（https://string‑db.org/），蛋白质结构数据库（prorein data bank，PDB）（https://www.rcsb.org/），生物信息学开源软件平台（Bioconductor）（http://www.bioconductor.org/）。软件：R 语言（V4.1.1）（https://www.r‑project.org/），Cytoscape（V3.7.0）（https://cytoscape.org/），PyMOL（V2.1.1）（https://pymol.org/），iGemdock（V2.1）（http://gemdock.life.nctu.edu.tw），AutoDock Tools（V1.5.6）（http://autodock.scripps.edu/）。

1.2 中药苍耳子化学成分收集及靶点预测 借助TCMSP 平台查找苍耳子的化学成分，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及药物相似性（drug‑likeness，DL）≥0.18 为条件进行筛选，获取药物的有效活性成分。继续运用TCMSP 数据库查找其有效活性成分的对应靶点，借助Uniprot 数据库对蛋白靶点进行人类基因标注并规范化处理。

1.3 过敏性鼻炎靶点筛选 以“Allergic rhinitis”为关键词，分别在疾病数据库OMIM、GeneCards和Dis-GeNET进行检索，对得到靶点进行汇总及去重处理。

1.4 “成分‑靶点”网络构建 借助Excel 2019 软件对1.2和1.3得到的结果进行比对，找出中药与疾病的共同蛋白靶点，并将其导入Cytoscape 软件平台，构建“成分‑靶点”网络。网络中节点由中药的活性成分和中药治疗疾病的靶点两部分构成。两者的相互关系以边表示。

1.5 蛋白相互作用（PPI）网络构建 将1.4 中找到的共同蛋白靶点导入在线数据库String 中进行分析，种属选择Homo sapien，将得到的蛋白相互作用关系数据（combined score≥0.4）进行下载，将所得数据导入Cytoscape 软件进行分析，按照度值大小选出药物治疗疾病的关键靶点。

1.6 GO 功能富集和KEGG 通路富集 运用R 语言将1.4 中找到的共同蛋白靶点进行基因本体论（gene ontology, GO）功能富集和（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析，得到苍耳子治疗过敏性鼻炎的主要功能富集和作用通路。

1.7 小分子优化处理 对1.4 得到的主要活性成分通过PubChem 数据库查找相应的3D 结构（或2D 结构）并下载“SDF”格式文件，用Pymol软件进行格式转换。将1.5所得到的治疗过敏性鼻炎的关键靶点通过PDB 数据库查找蛋白晶体结构，依据分辨率Resolution(A)、配体等条件进行筛选，选出最佳蛋白晶体结构并下载“PDB”格式文件。通过Pymol软件对所得到的蛋白晶体结构进行除水、剔除杂质等优化处理。

1.8 分子对接 用AutoDock Tools 软件对主要活性成分（配体）和优化后的蛋白晶体结构（受体）进行分子对接前数据处理。受体进行加氢、计算电荷、添加原子类型等结构处理并保存PDB 文件格式。配体进行root 判定及扭转键选择等操作处理并保存PDB 格式。利用iGemdock 软件对受体配体进行匹配筛选，找出最佳受体与配体的匹配方式。将最佳匹配方式运用AutoDock Tools软件进行分子对接。用Pymol软件对对接结果进行优化展示。

2 结果

2.1 中药化学成分收集及靶点预测 以OB≥30%、DL≥0.18 为条件在TCMSP 进行苍耳子有效成分的查找与筛选，得到有效活性成分11 个，搜索到有对应靶点的有效活性成分7 个（无对应靶点的有效成分已剔除），表1。

表1 苍耳子有效活性成分

2.2“成分‑靶点数据库”建立 通过查询疾病数据库OMIM、Gene Cards和DisGeNET，得到过敏性鼻炎疾病相关基因1 575个。通过与苍耳子蛋白基因进行比对，得到苍耳子治疗过敏性鼻炎的潜在靶点15个，构建“苍耳子‑过敏性鼻炎疾病靶点”数据库。

2.3 “成分‑靶点”网络构建 将“苍耳子‑过敏性鼻炎疾病靶点”数据库导入Cytoscape软件构建网络图（图1）。该网络图共有22个节点和26条边，图中紫色长方形代表疾病，黄色椭圆形代表药物，粉色八边形代表潜在靶点，蓝色六边形代表有效成分。

图1 苍耳子的有效成分‑靶点相互作用网络

经网络拓扑学分析后，将苍耳子的7 种有效成分按照度值大小排序，排名前4的有效成分为beta‑sitosterol（β 谷甾醇）、stigmasterol（豆甾醇）、aloe‑emodin（芦荟大黄素）、(2R,3R)‑3‑(4‑hydroxy‑3‑methoxy‑phenyl)‑5‑methoxy‑2‑methylol‑2，3‑dihydropyrano（5,6‑h）（1,4）benzodioxin‑9‑one（即 Cleomiscosin A，黄花菜木脂素A）。

2.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建 借助String 平台对苍耳子治疗过敏性鼻炎的潜在靶点进行分析，获得PPI网络图（剔除游离蛋白），图2。

图2 苍耳子治疗过敏性鼻炎的潜在靶点PPI网络图

对PPI 所得的数据按照度值进行可视化处理，图3。度值越大表明与其他蛋白的相互作用越强，地位越关键。

图3 蛋白相互作用度值数可视化

从图3 可知，度值较大的靶点蛋白分别是：细胞肿瘤抗原p53（tumor protein 53，TP53）、半胱氨酸蛋白酶‑3（cysteine protease‑3，CASP3）、雌激素受体（estrogen receptor，ESR1）、Myc 原癌基因蛋白（myc proto‑oncogene protein，MYC）、细胞凋亡调节因子Bcl‑2（apoptosis regulator bcl‑2，BCL2）及孕酮受体（progesterone receptor，PGR）。

2.5 GO 功能富集分析 运用R 语言对苍耳子治疗过敏性鼻炎的潜在靶点进行GO 功能富集分析，筛选条件：pvalueCutoff=0.05。通过Goplot 对结果进行展示，图4。

图4 苍耳子治疗过敏性鼻炎的功能‑靶点Goplot图

由图4 可知，靶点参与的生物过程主要有：参与神经胶质细胞凋亡过程（glial cell apoptotic process）、上皮管细胞的分支形态发生（branching morphogenesis of an epithelial tube）、上皮管细胞形态发生（epithelial tube morphogenesis）、分支上皮细胞的形态发生（morphogenesis of a branching epithelium）、分支结构细胞的形态发生（morphogenesis of a branching structure）、对紫外线的反应（response to UV）以及女性性特征的发育等。

2.6 KEGG通路富集分析结果

运用R 包（ClusterProfiler）对苍耳子治疗过敏性鼻炎的潜在靶点进行KEGG 通路富集分析，设定条件pvalueCutoff=0.05。在得到的结果中，选出显著性差异最大的20条通路绘制条形图，图5。

图5 苍耳子治疗过敏性鼻炎的潜在靶点KEGG富集通路条形图

由图5可知，靶点参与的信号通路有：甲状腺激素信号通路（Thyroid hormone signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、PI3K‑Akt信号通路（PI3K‑Akt signaling pathway），和相关疾病通路如乙型肝炎（Hepatitis B）、结肠直肠癌（Colorectal cancer）、小细胞肺癌（Small cell lung cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、麻疹（Measles）等。

2.7 分子对接结果 借助AutoDock Tools 软件对主要有效成分的小分子（配体）及关键蛋白靶点（受体）结构优化后，运用iGemdock 软件对配体与受体进行对接匹配（表2）。配体与受体结合能越低，表示两者发生作用的可能性就越大。由表2 可知MOL000011（即 Cleomiscosin A）与TP53、CASP3、ESR1、MYC及PGR均是最优对接形式。运用AutoDock Tools 软件对Cleomiscosin A 的最优结合模式进行分子对接验证（图6）。

图6 MOL000011与TP53、CASP3、ESR1、MYC及PGR蛋白的分子对接图

表2 主要有效成分与关键靶点的结合能

从图 6 可知，Cleomiscosin A 与TP53、CASP3、ESR1、MYC、PGR5 个靶点蛋白的氨基酸残基均形成了2个以上的氢键。

3 讨论

过敏性鼻炎为呼吸系统的常见疾病，发作具有明显的季节性。发作时，严重影响患者的正常工作与生活。随着对过敏性鼻炎研究的深入，人们发现其发病与鼻黏膜上皮细胞及上皮源性细胞因子、II型固有淋巴细胞、辅助T 细胞免疫失衡、Breg 细胞、树状突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞相关，是由辅助T细胞、肥大细胞等炎性细胞与IL‑4、IL‑5等细胞因子共同相互作用的结果[6]。苍耳子为传统中医治疗鼻炎的常用药物。现代药理学研究指出[7]，苍耳子含有脂肪酸、木脂素类级酚酸类等多种化学成分，并具有抗炎镇痛、抗菌、抗病毒等多种药理作用。通过小鼠动物实验研究发现[8]，苍耳子通过稳定肥大细胞膜，减少组胺等过敏介质的释放，抑制肥大细胞依赖性速发型过敏反应。

本研究通过对数据库的检索及数据处理，明确了苍耳子中 beta‑sitosterol、Stigmasterol、aloe‑emodin、Cleomiscosin A 是治疗过敏性鼻炎的主要有效成分。经过模拟分子对接发现，Cleomiscosin A 与TP53、CASP3、ESR1、MYC及PGR都能较好的结合。文献指出，Cleomiscosin A 为一种有机杂三环化合物，属于天然香豆素内酯范畴，具有抗炎活性，可抑制TSLP 表达[9]。TSLP 被认为是最常见的炎症性过敏性疾病，如哮喘、特应性皮炎及特应性鼻炎的主开关，在小鼠动物实验中[10]，当阻断TSLP 信号表达时，变应原特异性血清IgE 水平、嗜酸性气道组织炎症及Th2细胞因子水平等显著降低。Th2细胞因子水平与过敏性鼻炎的发生关系密切。当Th2 细胞因子活性增强时能诱导体内IgE 合成，促使前列腺素、白三烯及组织胺等递质释放，增加毛细血管通透性及腺体分泌，导致嗜酸性粒细胞水平升高，进而引起过敏性鼻炎的相关临床症状[11]。beta‑sitosterol 和Stigmasterol 均属于植物甾醇类，具有抗炎、抗氧化及免疫调节的作用。研究发现[12-13]，β‑谷甾醇具有降低血清组胺和IgE 水平，减少肥大细胞的产生及下调TSLP 水平的作用。豆甾醇在治疗IgE介导的过敏性疾病方面有巨大潜力。芦荟大黄素为蒽醌类生物活性成分，能通过抑制T 细胞达到机体免疫调节的功能[14]。以上研究表明，苍耳子通过多成分治疗过敏性鼻炎。

通过GO 功能富集以及KEGG 通路富集得出，苍耳子可能通过甲状腺激素信号通路、p53 信号通路及PI3K‑Akt 信号通路来达到调节上皮细胞及控制神经胶质细胞的凋亡，从而达到治疗过敏性鼻炎的作用。研究发现[15]，神经胶质细胞中的小胶质细胞能调节T细胞的增殖。T细胞和上皮细胞的异常是过敏性鼻炎诱发的因素[16-17]。

本研究借助网络药理学方法，展示了苍耳子治疗过敏性鼻炎的多成分、多靶点、多通路、多功能的作用特点，通过对T细胞和上皮细胞的调控来达到治疗过敏性鼻炎的目的。经过分子对接展示苍耳子发挥作用的可能过程，为后续实验验证提供理论指导。