Box‑Behnken 响应面法优化羟基积雪草酸固体脂质纳米粒的处方及体外释药行为研究

彭祎婧,罗怀青，丁劲松，黎 绫，赵雅芝,胡明华，马 宁

瘢痕增生是外科常见的一类皮肤疾病。我国传统中药积雪草，在临床上有广泛应用。然而，积雪草现有制剂因半衰期短，积雪草苷片，软膏等需每日三次给药,连续治疗3~6个月才会显效，易引起肝毒性[1-2]。另外，由于皂苷类成分水溶性大，在肠道或皮肤上的吸收较差[3]，使得现在临床上用的积雪草类药品生物利用度低、起效慢。因此开展新型制剂的研究对解决临床用药问题是十分必要的。羟基积雪草酸（madecassic acid,MA）是积雪草有效成份之一，具有阻抑内皮细胞凋亡的作用，促进伤口愈合[4]。研究表明[5]，MA 对瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用远强于其它皂苷类化合物。因此，本课题拟将其制成固体脂质纳米粒，解决其水溶性及透皮性能差的问题，为临床提供新的用药选择。

固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles ,SLN）是近20 年来发展较快的新型胶体给药系统，适用于水不溶性或毒性大的药物[6-7]。可利用生物相容性好并可生物降解的载体材料运载药物[8]，具有良好的缓控释作用和靶向性。本课题将羟基积雪草酸制备成羟基积雪草酸固体脂质纳米粒并考察了其体外释药行为特征，为进一步研发纳米凝胶剂提供了实验基础。(长沙湘仪贝克仪器仪表有限公司)。

1.2 药品与试剂 羟基积雪草酸原料药（湖北巨胜科技有限公司，批号：20191001，纯度：85.5%）；羟基积雪草酸对照品（成都普思生物科技有限公司，批号：PS020268，纯度：98.3%）；山嵛酸甘油酯（上海延拓生物科技有限公司，批号：20190701）；大豆磷脂（上海麦克林生化科技有限公司，生物技术级）；吐温‑80（批号：20160812，上海厚诚精细化工有限公司）；泊洛沙姆188（上海厚诚精细化工有限公司，批号：20161025）；磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司，AR 级）；乙腈、甲醇为色谱纯（美国Tedia公司）；水为自制超纯水。

1 材料

1.1 仪器 LC‑20A 高效液相色谱仪（岛津）；KQ‑3200DB 型超声波清洗机（巩义市予华仪器有限责任公司）；BP211D 十万分之一天平（德国Sartorius公司）；FB‑110Q‑PLUS 超高压均质机（上海励途机械设备工程有限公司）；LC‑FB 型剪切分散机（上海励途机械设备工程有限公司）；UV7500紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；90 plus Zeta粒径分析仪（美国布鲁克海文仪器公司）；DF‑101S 恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司）；TGL‑20M台式高速冷冻离心机（长沙湘仪贝克仪器仪表有限公司）；SHA‑C水浴恒温振荡器（江苏金城国胜实验仪器厂）；JY92‑IIN 超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；HT7700透射电子显微镜（日立高新技术公司）；透析袋(MD34 分子量截止值8000~14000 d，VISKASE)；CCH‑M10 超纯水仪(湖南创纯)；SHA‑C 水浴恒温振荡器(江苏金坛金城国胜仪器厂)；RYJ‑12B 药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器有限公司)；TGL‑20M 高速离心机

2 方法

2.1 MA‑SLN 的制备 采用溶剂乳化挥发‑高压均质法制备MA‑SLN。称取处方量的山嵛酸甘油酯、大豆磷脂在恒温（90±1）℃水浴磁力搅拌下熔融，另取处方量的羟基积雪草酸加入适量无水乙醇超声溶解后加入上述液体中混合均匀，形成油相。称取处方量的吐温‑80（T‑80）与泊洛沙姆188（P‑188）分散于50 mL 水中，在同温水浴条件下充分溶解形成水相。在 90 ℃水浴恒温和 1000 r·min‑1搅拌条件下将油相缓慢加入水相中，继续搅拌40 min挥去有机溶剂得到粗分散液。高速剪切（10000 r·min‑1）3 min 形成初乳，在高压均质 800 bar 下均质 8次，冰水浴冷却即得MA‑SLN 分散液。空白SLN 的制备方法除不加药物外，其他过程与MA‑SLN 分散液制备方法相同。

2.2 MA的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Ultimate LP‑C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈‑10 mmol·L-1磷酸二氢钾（60:40）；流速1 mL·min‑1；检测波长205 nm；柱温35 ℃；进样量20 μL。

2.2.2 方法学考察 精密称取羟基积雪草酸对照品9.72 mg，置于100 mL 容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，制得羟基积雪草酸对照品储备液。分别从储备液中移取一定量溶液，甲醇稀释定容，配制成浓度范围为 9.72～97.2 μg·mL‑1系列对照溶液。按“2.2.1”项下色谱条件测定。

2.3 包封率和载药量的测定 采用透析袋法测定纳米粒的包封率和载药量。MA‑SLN总药量(M总)测定：精密量取1 mL 纳米粒混悬液于50 mL 容量瓶中，甲醇超声溶解并定容。所得溶液用0.22 μm 滤膜过滤，按“2.2”项下方法测定药物总质量浓度W总。另精密量取纳米粒混悬液2 mL 置于透析袋中，密封，置于40 mL 乙醇‑pH7.4 的磷酸盐缓冲液（2:8）中，37 ℃条件下振摇30 h(150 r·min‑1)，吸取适量透析介质，过滤后按“2.2.1”项下方法测定游离药物质量浓度，记为W游。计算公式为包封率=(M总-M游)/M总×100%，载药量=(M总-M游)/M(脂质+药物)×100%。

2.4 Box‑Behnken响应面法优化MA‑SLN处方

2.4.1 处方优化实验设计 根据前期处方筛查单因素考察结果，选取对纳米粒性质影响最大的三个因素[山嵛酸甘油酯用量（X1），P188 与 T-80 用量比（X2），药物含量（X3）]为考察对象，因素水平见表1。以包封率（Y1）和载药量（Y2）为评价指标，采用综合加权评分法对实验结果进行拟合分析，综合评分Y(OD)=0.5×Y1i/Y1max+0.5×Y2i/Y2max，利用Box-Behnken响应面法优化MA-SLN处方，实验安排，表1。

表1 Box-Behnken响应面因素及水平

按上表进行实验并对数据进行处理及模型拟合，通过效应面优化与预测，得出最佳处方和制备工艺，制得MA-SLN样品。

2.5 MA‑SLN 的质量评价 利用透射电镜观察MA-SLN 的外观形态，采用90 plus Zeta电位粒径分析仪测定纳米粒的粒径、粒度分布及Zeta 电位。

2.6 体外释放累积释药率测定 取透析袋于使用前在超纯水中煮沸0.5 h，接收介质为20%乙醇的PBS缓冲液(pH=7.4)[9]。取1.0 g MA-SLN 和自制0.25%羟基积雪草酸乙醇溶液1.0 mL 各3 份，分别置于透析袋中，两端扎紧放入离心管，加入40 mL 接收介质，置恒温振荡器，振摇。介质温度为恒温37 ℃，于1、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h 取样2.0 mL，迅速补充同温度接收介质2.0 mL。样品经0.22 μm有机系滤膜过滤后HPLC 测定浓度，计算药物各不同时间点的累积释放量Qn，以累积释药率Q%对释药时间T作累积释放曲线图，拟合MA-SLN释药模型方程。

公式中，Qn代表累积释放量;Q%代表取样点n的累积释药率;V和V0分别代表接收介质的体积和取样体积;Cn 代表取样点n 的药物浓度；W 为凝胶剂中含药量。

2.7 体外渗透试验

2.7.1 MA‑SLN 透皮试验 洗净新鲜猪耳皮肤，剪去毛发，剔除皮下脂肪，确保表皮完整，除去皮下脂肪组织和皮肤结缔组织，生理盐水洗净后，将猪耳皮肤于冰箱‑20 ℃保存，备用。在Franz立式扩散池放置受试皮肤，渗透有效皮肤面积2.54 cm2，将皮肤角质层朝供给室，真皮层朝接受室。在接受室中注入7.0 mL的20%乙醇的PBS缓冲液(pH=7.4)为接收介质，将接受室置于150 r·min‑1的透皮扩散试验装置中磁力搅拌，将0.79 g 羟基积雪草酸溶液剂（含MA2.17 mg)、0.55 gMA-SLN(含 MA2.17 mg)置于皮肤上，分别在1、2、3、4、6、8、10、12、24 h 分别取样2 mL，并及时补充2 mL 新鲜接收介质；样品过0.22 μm 有机系滤膜进HPLC 测定药物浓度，计算累积渗透药量，拟合渗透动力学模型，获得经皮稳态渗透速率 Js/μg. cm‑2h‑1。Js 为拟合模型的斜率，按下列公式计算累积渗透量Q:

公式中，Q 为累积渗透量；V 和V0分别代表接收介质在接受室的体积和采样体积；Cn为取样点n的药物浓度；A为渗透有效皮肤面积。

2.7.2 在皮内滞留量的测定 透皮试验结束后取出猪耳皮肤，去除表面残留的试验制剂，将试验制剂冲洗干净，滤纸吸水，将皮肤剪碎后置15 mL 离心管，加2 mL甲醇浸泡12 h，超声离心，0.22µm有机系滤膜滤过，HPLC测定，计算羟基积雪草酸皮肤滞留量。

3 结果

3.1 含量测定方法 以羟基积雪草酸质量浓度（C）对峰面积（A）进行线性回归，得到标准曲线方程为：A=10153C+5469.3，r2=0.9998。羟基积雪草酸在9.72~97.20 μg·mL-1范围内，其浓度与峰面积线性关系良好。羟基积雪草酸的保留时间约为5.2 min，辅料对羟基积雪草酸的测定无干扰（图1，2）。日内、日间精密度RSD%小于2%；回收率在94.92%~102.85%，RSD为1.62%,溶液在48 h室温下稳定，本法可用于羟基积雪草酸含量测定。

图1 羟基积雪草酸对照品色谱图

图2 羟基积雪草酸纳米粒色谱图

3.2 Box‑Behnken响应面法优化MA-SLN处方

3.2.1 利用 Box‑Behnken 响应面法优化 MA‑SLN处方 实验结果如下表2。

表2 Box-Behnken实验设计与结果

采用Design Expert 8.0 软件对数据进行分析处理，该软件对数据分别进行了线性、两因素交互作用、完全二次多项式模型拟合，得出的最佳拟合模型其拟合方程如下：Y＝0.83‑0.10 X1+0.014 X2+0.070X3+0.0075 X1X2-0.040 X1X3-0.015 X2X3+0.014对二项式方程中的各项系数进行方差分析，结果，表3。

由表3 结果可知，R2=0.9765，说明模拟程度良好，实验误差较小，模型相关度良好。X1对包封率和载药量有极显著影响（P<0.01），X3对包封率和载药量有显著影响（P<0.05），交互项中X1X3对包封率和载药量有显著影响（P<0.05），二次项中X22、X32对包封率和载药量也有显著影响（P<0.05）。

表3 回归方程显著性检验

3.2.2 效应面优化与预测 应用Design Expert 8.0实验设计软件，绘制处方各因素X1、X2和X3对响应值Y的效应曲面图，结果（图3）。根据Box‑Behnken响应面实验设计结果。

图3 Y与山嵛酸甘油酯用量(X1)、P188与T-80用量比(X2)、药物含量(X3)的响应面图

选出各因素的最佳取值范围，得到各因素的最佳取值：山嵛酸甘油酯 300 mg，P188 与 T‑80 用量比为1∶1，羟基积雪草酸含量为230.87 mg。

按此最优处方制备样品（图4）。在该条件下，样品的平均载药量为21.53%，平均包封率为84.09%，平均综合评分为0.974，预测综合评分为0.973，偏差0.1%，表明建立的数学模型较好，优化工艺参数可靠。

图4 羟基积雪草酸固体脂质纳米粒样品

3.3 质量评价 利用透射电镜观察MA‑SLN的外观形态，结果显示纳米粒为球形或类球形实心粒子，大小均匀，外观圆整（图5）。采用90 plus Zeta 电位粒径分析仪测定纳米粒的粒径、粒度分布及Zeta电位。实验结果显示，MA‑SLN 的平均粒径为（226.8±11.2）nm，PDI为（0.19±0.08），Zeta 电位为（‑25.11±3.24）mV，粒径分布范围窄，呈正态分布（图6,7）。

图5 MA‑SLN透射电镜图（×100000倍）

图6 MA‑SLN粒径分布

图7 MA‑SLN Zeta电位

3.4 体外累积释药率测定结果 对按优化处方制得的MA‑SLN 样品，进行体外累积释药率测定，结果见图8，拟合方程，表4。

表4 羟基积雪草酸累积释药拟合方程

图8 羟基积雪草酸体外释放累积释放度曲线(n=3)

结果表明，MA‑SLN 体外累积释放在 8、12、24 h 分别是39.72%、53.16%和75.63%，符合一级模型。而羟基积雪草酸溶液剂，在4 h 时累积释药率为97.36%，药物已基本释放完全，说明MA‑SLN 具有缓释作用。

3.5 体外渗透试验 羟基积雪草酸溶液和羟基积雪草酸固体脂质纳米粒溶出量Qi 随时间变化曲线和透皮动力学方程参数分别见图9和表5。

表5 羟基积雪草酸透皮动力学方程及透皮参数

图9 羟基积雪草酸经皮Qi‑t关系图（n=3）

结果表明，MA‑SLN 的经皮稳态渗透速率及24 h 累积渗透量均远高于羟基积雪草酸溶液1.6 倍，说明MA‑SLN透皮性能有较大改善。

3.6 皮内滞留量的测定 透皮试验结束后取出猪耳皮肤，去除表面残留的试验制剂，将试验制剂冲洗干净，滤纸吸水，将皮肤剪碎后置15 mL 离心管，加2 mL甲醇浸泡12 h，超声离心，0.22µm有机系滤膜滤过，HPLC 测定，计算羟基积雪草酸皮肤滞留量，表6。

表6 羟基积雪草酸累积渗透量及皮内滞留量（n=3)

结果表明，MA‑SLN 因其固体脂质结构运载羟基积雪草酸，透过皮肤角质层而滞留于皮肤深层，滞留量是普通溶液剂的2倍，更有利于发挥疗效。

4 讨论

固体脂质纳米粒系将药物包裹或夹嵌于类脂中而制备的固体胶粒给药系统，可有效提高难溶性药物的口服吸收生物利用度，是一种新型递释系统。羟基积雪草酸是积雪草有效成分中抑制瘢痕形成最强的化合物[5]，但因难溶于水等因素而限制应用。本课题采用溶剂乳化挥发-高压均质法制备MA‑SLN，其经皮稳态渗透速率和皮内滞留量约是普通溶液剂的1.6 倍和2 倍，提示固体脂质体是一种能有效促进羟基积雪草酸经皮渗透的载体。但是SLN并不适合于皮肤给药，故本课组下一步将开展纳米凝胶系统的研究，有望为增生性瘢痕的治疗提供更好的用药选择。

包封率和载药量是评价脂质体制剂质量的重要指标，测定方法包括葡聚糖凝胶柱色谱法、透析法和超速离心法等。本课题比较了超滤离心法和透析袋法对MA 吸附的影响。结果显示，超滤离心法对纳米粒吸附率为（26.9±5.9）%，是透析袋法（9.8±1.6）%的2.7 倍。因此，选择透析袋法测定包封率和载药量。

接收介质的选择，预实验曾试用过生理盐水、PBS 缓冲液、20%乙醇的生理盐水等。因羟基积雪草酸不溶于水，生理盐水、PBS 缓冲液均不能形成漏槽条件。参照文献方法[9]，选择20%乙醇的PBS缓冲液（pH=7.4）能溶解羟基积雪草酸，且形成较好的漏槽条件。

离体透皮试验中皮肤的选择要根据不同动物皮肤渗透性。有研究表明[10-11]：猪、猴的皮肤渗透性与人皮肤相近，家兔、大鼠、豚鼠的皮肤渗透性比人皮肤大。因猪耳的皮肤容易得到，所以本文透皮介质选择了猪耳。