右心衰、结核及肿瘤性患者胸腔积液中性粒细胞内p38蛋白对IFN-γ及TNF-α表达的影响及意义

陈 乾，杨 静，张建银，沈 乐，李 萍，耑 冰，董 辉

胸腔积液(PE)是呼吸内科常见病和多发病症,临床根据PE的理化指标区分渗出液和漏出液，然后推测PE的病因并给予相应的治疗。对于不同病因的PE，其内细胞成分差异很大，而造成这种差异的原因至今不明[1-2]。本研究通过观察右心衰、结核以及肿瘤性PE内中性粒细胞中p38蛋白对IFN-γ和TNF-α表达的潜在影响，探寻中性粒细胞在不同病因所致PE内分布差异的可能原因。

1 资料与方法

1.1 一般资料:收集2016年1月-2017年12月我院呼吸内科首诊、病因明确、单一病因导致的PE住院患者71例为研究对象，其中男性30例，女性41例。采集其外周静脉血样5 mL/人，收集血样内的中性粒细胞。第一时间通过胸腔闭式引流术抽取PE 20 mL，经特定步骤收集中性粒细胞(NEU),根据NEU来源患者的病因不同，将其分为心衰组(HF组)12例，患者平均年龄(62.91±6.20)岁;结核组(TB组)18例，患者平均年龄(40.05±7.33)岁;恶性组(CA组)15例，患者平均年龄(54.07±7.29)岁。收集另外一个TB组患者的NEU，向其中加入p38蛋白抑制剂SB203580孵育2 h(SB203580浓度为10 μmol/L)，该组记为TB+SB203580组,患者15例，平均年龄(42.93±9.07)岁；收集另外一个CA组患者的NEU，向其中加入SB203580孵育2 h(SB203580浓度为10 μmol/L)，记为CA+SB203580组，患者11例，平均年龄(61.27±6.40)岁；同期选择我院体检中心健康体检者20人(对照组)，平均年龄(44.30±11.42)岁。以上患者一经入院，经患者同意，签署“知情同意书”。本研究的实验方案、患者“知情同意书”等相关资料在实施之前，上报宁夏回族自治区人民医院伦理委员会批准后实施。

1.2 纳入标准:①年龄>18岁；②能正确表达自己意愿；③慢性肺源性心脏病所致的心衰源性PE的患者；④结核性胸膜炎导致的结核性PE患者；⑤恶性肺部病灶胸膜转移导致的恶性胸水患者；⑥患者临床资料齐全，自愿参与本研究并签署知情同意书。

1.3 排除标准:①复杂病因导致的PE(合并其他重要脏器疾病，如冠心病、结构性心脏病、先天性心脏病、血液系统疾病、风湿免疫系统疾病、肝肾功能不全、各种传染性疾病导致的PE等)；②合并高血压、糖尿病、左心功能不全的患者；③存在类肺炎旁胸水的患者；④拒绝签署知情同意书的患者。

1.4 诊断标准:渗出性PE和漏出性PE诊断标准符合第八版《内科学》胸腔积液一节中的相关实验室指标。

1.4.1 右心衰所致PE临床认定 ：①符合漏出液的诊断标准；②患者可明确诊断为慢性肺源性心脏病，本文所指的心衰均系指右心衰；③胸膜活检排除结核及恶性肿瘤；④普通PE培养结果阴性。

1.4.2 结核性PE临床认定：①符合渗出液的诊断标准，胸水腺苷脱氨酶>30 U/L；②胸膜病理活检发现朗汉氏巨细胞；③普通胸水培养结果阴性，结核分枝杆菌培养阴性或阳性。

1.4.3 恶性PE临床认定：①符合渗出液的诊断标准；②患者胸膜活检确认为肺部恶性病灶或在胸水中找到恶性细胞；③普通胸水培养结果阴性，结核分枝杆菌培养阴性。

1.5 主要检测试剂:中性粒细胞分离试剂盒(天津灏洋)，全血及组织稀释液(天津灏洋)，红细胞裂解液(天津灏洋)，细胞洗涤液(天津灏洋)、Trizol试剂(南京凯基)，总RNA提取试剂盒(南京凯基)，反转录试剂盒(大连宝生物)、全蛋白提取试剂盒(南京凯基)，磷酸化蛋白提取试剂盒(南京凯基)，BCA蛋白定量试剂盒(南京凯基)；兔抗人p38一抗(北京博奥森)，兔抗人IFN-γ一抗(北京博奥森)、兔抗人TNF-α一抗(北京博奥森)、β-actin一抗(北京博奥森)、山羊抗兔二抗(北京博奥森)，p38蛋白抑制剂SB203580(Selleck生物)。

1.6 研究方法

1.6.1 血液样本NEU提取:取5 mL全血标本，加入组织稀释液2 mL混匀，加入中性粒细胞分离液，500 g离心25 min，此时离心管从上至下分为四层，弃去第一、第二层细胞，收集第三层和第四层细胞，染色并放入显微镜下观察。随后加入细胞洗涤液10 mL，混匀后200 g离心30 min，沉淀1次，洗涤后用红细胞裂解液裂解红细胞，再经3次洗涤祛除红细胞及碎片后，吸取沉淀细胞即为所需NEU。

1.6.2 胸水内NEU提取:取10 mLPE，离心弃上清液，全部细胞沉淀，PBS重悬，冲洗两次，制成单细胞悬液。然后参照1.6.1的步骤提取PE内中性粒细胞。

1.6.3 各组NEU内p38蛋白及p-p38的表达:分别将各组获取的NEU裂解，提取NEU内全蛋白，BCA蛋白定量，取样，经上样(上样量40 μg)、电泳、转膜、封闭、滴加兔抗人p38一抗(一抗稀释度1∶3 000)4 ℃摇晃12 h，PBST转膜15min，共3次；滴加生物素标记二抗，4 ℃摇晃3 h，PBST洗膜后行ECL发光，胶片曝光，使用凝胶成像系统进行灰度分析，Western-blot法测定各组p38蛋白条带光密度值及β-actin条带光密度值，两者之比作为p38蛋白表达的相对值；使用同样的方法获得磷酸化的p38蛋白(p-p38蛋白表示磷酸化的p38蛋白)表达相对值。

1.6.4 各组NEU内IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA表达:分别以各组获取的NEU为研究对象。裂解NEU，Trizol试剂提取NEU内总RNA，逆转录合成cDNA，用特异性扩增IFN-γ的引物(F：5′ -GATGAAACCCTCAGAAGC -3′； R：5′-ATCTCCCAGGCACAGTCA-3′，117 bp)和TNF-α的引物(F：5′-CGAGTGACAAGCCTGTAGCC-3′；R：5-TGAAGAGGACCTGGGAGTAGAT-3′，171 bp)，以β-actin(F：5′-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′；R： 5′-CCTTCACCGTTCCAGTTTT-3′,149 bp)作为内参进行Realtime PCR(PCR扩增参数：预变性95 ℃ 3 min；变性95 ℃ 20 s，退火57 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s，40个循环；最后延伸65 ℃ 10 min)，Realtime PCR检测得到数据，根据2-△△Ct法分析IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA表达水平。

1.6.5 各组NEU内IFN-γ和TNF-α的表达:以各组获取的NEU为研究对象，使用类似1.6.3中的方法，Western-blot法分别检测NEU内IFN-γ蛋白、TNF-α蛋白表达的相对值。

2 结果

2.1 患者一般资料:各组平均年龄比较差异有统计学意义(F=18.84，P<0.05)，HF组年龄(62.91±6.20)岁，TB组年龄(40.05±7.33)岁，各组患者一般资料见表1。

表1 各组一般资料比较

2.2 各组NEU内p38蛋白、p-p38蛋白的表达:与对照组相比，其他各组p38蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组相比，其他各组p-p38蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05),其中，HF组p-p38蛋白表达水平高于对照组；组间比较发现，各组p-p38蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，TB组及CA组p-p38蛋白表达水平高于其他各组，而TB+SB203580组、CA+SB203580组p-p38蛋白表达水平分别低于TB组和CA组；结果见表2、图1(目录后)。

2.3 各组NEU内IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA、IFN-γ及TNF-α表达:与对照组相比，各组IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA的表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)，HF组IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA的表达水平均高于对照组；组间比较发现，各组IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA的表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)，其中TB组、CA组IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA表达水平高于其他各组；而TB+SB203580组、CA+SB203580组IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA表达水平分别低于对应的TB组、CA组，见表3。

与对照组相比，各组IFN-γ、TNF-α蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)，HF组IFN-γ、TNF-α表达水平均高于对照组；组间相比发现，各组IFN-γ、TNF-α的表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)，其中TB组、CA组IFN-γ、TNF-α表达水平高于其他各组；TB+SB203580组、CA+SB203580组IFN-γ、TNF-α表达水平分别低于对应的TB组、CA组，见表3与图2-图3(目录后)。

表3 各组INF-γ mRNA、TNF-α mRNA、INF-γ、TNF-α的表达相对值

3 讨论

众所周知，PE的形成原因众多。其内细胞及蛋白成分极其复杂。目前，对于PE内细胞成分差异的原因缺乏研究[1]。但可以断言的是PE细胞成分的差异，必定与细胞间极其复杂的信号转导密切相关，而这也将为判断PE性质提供了重要的线索信息。

本研究以临床中常见的右心衰、结核以及恶性PE内NEU为研究对象，观察了NEU内p38蛋白及p38蛋白抑制剂SB203580对IFN-γ和TNF-α转录及蛋白表达的影响。我们发现各组NEU内p38蛋白表达无差异，而p-p38蛋白表达存在差异，这再次印证了我们前期的研究：p38蛋白通过p-p38蛋白参与信号传递作用[3]。本研究发现，TB组及CA组p-p38蛋白表达水平高于其他各组，HF组p-p38蛋白表达高于对照组，这提示右心衰、结核及肿瘤性因素均可增加PE中NEU内p38蛋白的磷酸化水平(即p-p38升高)。这种变化趋势与Tiegang Liu等人[4]的研究一致，Tiegang Liu等人在炭毒素导致大鼠PE的研究中认为炭疽毒素可提高p-p38蛋白的水平。而本研究中，无论哪种因素(右心衰、结核及肿瘤)均可以推高机体炎症水平，从而诱发PE产生。

本研究发现TB组、CA组NEU内IFN-γ mRNA、IFN-γ的表达水平均升高，HF组IFN-γ mRNA、IFN-γ表达水平高于对照组。提示右心衰、结核以及肿瘤因素均可提高NEU内IFN-γ mRNA及IFN-γ表达水平；该结果与Carolyn R等人[5]的结果类似，中性粒细胞在受到炎症等因素刺激后，可不依赖白介素12(IL-12)独立产生IFN-γ，而IL-12诱导产生IFN-γ[6]。国内彭伟等人[7，8]研究结果亦与我们的结果类似，他们发现p-p38蛋白可促进CD4+T细胞(Jurkat细胞)表达IFN-γ。另外，本研究中使用p38蛋白抑制剂SB203580，通过对p-p38蛋白的抑制，可以观察到TB+ SB203580组、CA+ SB203580组中IFN-γ mRNA相对值、IFN-γ表达相对值明显减低，这就间接证明了IFN-γ的转录和表达与p38蛋白密切相关，但凡可影响到p-p38蛋白的表达量，即可提高IFN-γ的转录和表达水平。

本研究发现TB组、CA组TNF-α mRNA、TNF-α表达水平均升高，HF组TNF-α mRNA、TNF-α表达水平亦高于对照组。该结果提示右心衰、结核以及肿瘤因素亦可提高胸水NEU内TNF-α的转录及表达水平；类似的，TB+SB203580组、CA+SB203580组TNF-α mRNA、TNF-α表达水平分别低于TB组和CA组，提示TNF-α的转录与表达与p38蛋白密切相关。p38蛋白不仅可以调控TNF-α基因翻译的起始阶段，还参与TNF-α mRNA稳定性的维持。而生成的TNF-α还可以通过多途径激活更多的p-p38蛋白；这也从侧面印证了我们的研究中出现的情况：p-p38蛋白升高，TNF-α mRNA及TNF-α表达亦升高的趋势，抑制p-p38蛋白后，TNF-α mRNA及TNF-α的表达亦降低。Carolyn R等人的[5]研究指出，炎症刺激后的中性粒细胞，其产生IFN-γ可以不依赖IL-12,但是需要TNF-α及IL-1β的调节。所以文献[9]报道称将IFN-γ与TNF-α联合检测可提高结核性胸水诊断的灵敏度和特异度，确有其分子生物学基础。

综上所述，我们认为右心衰性PE、结核性PE以及恶性PE内NEU中的p-p38升高，将导致IFN-γ和TNF-α在转录及蛋白表达的水平升高。p38蛋白抑制剂SB203580可通过抑制p38蛋白的磷酸化而降低结核组及肿瘤组中性粒细胞内IFN-γ和TNF-α在转录和蛋白表达的水平，这种机制参与了中性粒细胞在不同病因的PE内的分布差异。而对于IFN-γ和TNF-α的其他来源(比如来源于T细胞的IFN-γ和来源于巨噬细胞的TNF-α)如何影响NEU内IFN-γ和TNF-α表达及调控，目前仍缺乏研究[10-11]，仍有待于进一步深入研究。