茯苓四逆汤调节TLR-4/NF-κB 通道对脓毒症大鼠心肌抑制的保护机制研究*

黄壑霏，彭晓洪，黄亚秀，陈冬杰，黄永莲，王评

广东省深圳市北京中医药大学深圳医院（龙岗） 广东深圳 518172

关健词 茯苓四逆汤；脓毒症；TLR -4/NF-κB 信号通路；心肌抑制

脓毒症病情凶险，一旦发生，治疗难度大，死亡率高[1]。炎症反应是脓毒症的重要发病机制之一，也是诱发多脏器损伤的重要疾病基础[2]。脓毒症极易并发心肌抑制[3-4]，由此成为脓毒症患者主要死亡原因之一[5]。脓毒症心肌抑制发病机制尚不明确，与炎症反应、细胞凋亡等多种因素相关。研究发现，Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR-4）通过识别脂多糖而激活单核细胞，最终活化核转录因子-κB（Nuclear transcription factor-κB，NF-κB）通路，使白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等表达上调，从而激活炎症反应[6-7]。目前，脓毒症心肌抑制无特异性治疗，相关对症治疗药物对预后的改善不明确。动物实验证实[8-9]，多种中药复方通过抑制炎症反应减轻脓毒症大鼠心肌损伤、进而改善预后。我们前期研究发现，茯苓四逆汤可以降低慢性心衰患者血清TNF-α水平[10]，减轻老年脓毒症大鼠心肌损伤，降低死亡率[11]。本研究观察该方对脓毒症大鼠心肌炎症因子表达的影响，探讨其心肌保护的作用机制。

材料与方法

1 试验动物

SPF级 SD雄性大鼠 120只，体重（210g±20）g，购自斯莱克动物研究中心（许可证号：SCXK（沪）2017-0005）。实验开展前已通过医院伦理委员会审查。

2 试药与仪器

2.1 药物 茯苓四逆汤组成：干姜8g，制附子10g，人参5g，茯苓30g，炙甘草10g，由本院中药房提供，煎煮成含原生药1g/mL，过滤除菌分装4℃保存备用。参照文献[12]计算灌胃剂量，210g大鼠等效剂量为1.3g，低、中、高剂量分别为 1.3g/d、2.6g/d、3.9g/d。

2.2 试剂 GAPDH（美国CS公司），BCA法蛋白浓度测定盒（深圳辉诺生物科技公司），磁珠法组织RNA提取试剂盒（北京天根生化公司），兔抗大鼠NF-κB抗体、兔抗大鼠心型脂肪酸结合蛋白（Heart type fatty acid binding protein，H-FABP）抗体、内参Gapdh单抗、羊抗小鼠二抗及羊抗兔二抗（Abcam，英国）。3）仪器：台式冷冻高速离心机（美国Sorvall，Fresco D-37520型），PCR仪（美国 ABI公司，7500型），电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司，HWS28型），凝胶成像系统（上海天能，GIS2009型），蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱和酶标仪，均为美国Bio-Rad公司生产，移液器（美国Gilson公司），组织匀浆器（美国Pro Scientific，PRO200型）等。

3 分组与动物模型制备

3.1 分组 所有大鼠按照随机数字表法分为6组：正常组，假手术组、模型组、中药低、中、高剂量组，每组20只。

3.2 动物模型制备 采用盲肠结扎穿孔术 （cecal ligation and puncture，CLP）法造模。予0.4mL/kg 10%水合氯醛注射大鼠腹腔，将麻醉后大鼠固定，消毒腹部皮肤后切开剑突下2cm处腹壁，分离出盲肠，在1/3处结扎后使用21G针头贯通挤压出少许肠内容物，将其回纳腹腔并缝合腹壁。术后予液体复苏及复温，单独喂养。假手术组：开腹分离盲肠，但不结扎及穿刺，盲肠回纳后关腹。正常组不做任何处理。

4 干预方法

造模成功后，大鼠正常喂养。中药低、中、高剂量组予相应剂量茯苓四逆汤（1.3g/d，2.6g/d，3.9g/d），加生理盐水稀释至5ml，造模成功后6h灌胃，分两次给药，连续3d，正常组、假手术组、模型组同时间点予等量生理盐水灌胃。

5 观察指标

5.1 一般项目观察及取材 观察大鼠的生存状态（精神状态、饮食、体质量等），记录大鼠生存时间。各组于术前及术后24h、48h、72h各取5只大鼠处死，取出新鲜心脏样本后，用液氮速冻，-80℃保存。

5.2 心肌组织IL-6、TNF-α含量测定 心肌组织匀浆后，12000rpm离心5min，取上清，采用ELISA法检测IL-6、TNF-α含量，操作按试剂盒（深圳辉诺生物科技公司）说明进行。

5.3 Western blott检测 H-FABP、NF-κB蛋白表达

将心肌组织切碎，加入RIPA裂解液后在匀浆机中研磨，充分裂解后，12000rpm离心5min，取上清，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，经灌胶、电泳、电转、封闭后分别与NF-κB、H-FABP及Gapdh的一抗（抗体滴度分别为1：1000，1：5000）4℃杂交过夜，然后TBST洗膜3次，与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（Jackson 1∶5000）作用室温孵育2h，再次洗膜5次，加ECL显色，上机检测。以 GAPDH条带作为内参，结果用靶蛋白/GAPDH 灰度比值表示。

5.4 QPCR检测TLR4 mRNA表达 将心肌组织切碎，液氮研磨成粉状，加入RIPA裂解液漩涡震荡混匀，采用磁珠吸附方法抽提组织RNA。使用RTreagent Kit反转录试剂盒（Takara生产，货号RR047A），将1μg RNA 样本反转录成cDNA进行后续RT-PCR检测。RT-PCR检测采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒（深圳辉诺生物科技公司生产，货号MX200017），严格按照操作说明书进行。采用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 系统，两步法 PCR扩增标准程序进行PCR反应。相关基因引物序如下：rTLR4：CCGCTCTGGCATCATCTTCATGGGTTTT AGGCGCAGAGTT，rGAPDH：AGGTGACCGCATCTTCTTGTTACGGCCAAATCCGTTCACA。

6 统计学处理

采用 SPSS 21.0统计软件进行分析。计数资料采用χ2检验。计量数据以（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05显示有统计学意义。

结 果

1 一般性观察

模型组大鼠前24h死亡3只，24～48h死亡2只，普遍出现进食水减少、蜷缩、毛发蓬松、精神萎靡等症状。低、中剂量组前24h各有1只大鼠死亡，高剂量组无死亡大鼠。中药各组大鼠症状较模型组轻。模型组死亡率高于中药各组总死亡率（χ2=6.23，P=0.012）。假手术组大鼠术后进食及活动量有所下降，后逐渐恢复正常。正常组活动及进食正常。

2 各组TNF-ɑ、IL-6水平比较

模型组及中药各剂量组心肌TNF-ɑ、IL-6含量术后均较正常组明显升高（P＜0.01）。随着时间延长，TNF-ɑ、IL-6含量逐渐降低。中药各组与模型组同时间点TNF-ɑ、IL-6比较差异也有统计学意义（P＜0.01）；中药各组之间比较，剂量越高，TNF-ɑ、IL-6降低越明显（P＜0.01或P＜0.05）。见表 1。

表1 各组TNF-ɑ、IL-6水平比较（）

表1 各组TNF-ɑ、IL-6水平比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与低剂量组比较，cP＜0.05，dP＜0.01；与中剂量组比较，eP＜0.05

指标 时间 只数 正常组/pg·mL-1假手术组/pg·mL-1模型组/pg·mL-1低剂量组/pg·mL-1中剂量组/pg·mL-1高剂量组/pg·mL-1 IL-6术前 5 189.64±5.81 187.35±6.02 191.86±9.41 188.92±12.91 189.82±8.32 187.08±10.86术后 24h 5 187.43±5.85 195.35±7.93 585.22±31.52a 472.62±16.34ab 361.48±12.42abc 291.34±14.68abde术后 48h 5 187.57±5.78 192.61±7.52 455.07±25.42a 377.47±15.73ab 294.35±14.54abc 255.88±14.23abde术后 72h 5 188.78±5.63 194.45±8.31 374.71±12.73a 300.92±25.04ab 266.45±18.95abc 212.76±16.54abde TNF-ɑ术前 5 182.44±9.33 184.14±8.37 183.52±10.85 185.35±10.26 184.37±9.26 183.63±11.42术后 24h 5 183.71±9.42 189.72±9.15 677.83±62.76a 585.92±43.07ab 486.23±25.33abc 422.86±32.04abde术后 48h 5 180.18±9.47 188.37±8.98 527.84±40.34a 477.79±32.45ab 395.49±22.45abc 342.24±32.87abde术后 72h 5 184.22±9.84 186.28±8.27 409.66±52.85a 381.46±20.66ab 284.16±26.97abc 228.66±33.05abde

3 各组NF-κB、H-FABP蛋白表达比较

正常组、假手术组心肌组织NF-κB 和H-FABP蛋白表达水平低。模型组及中药各剂量组造模成功后检测到的蛋白水平比正常组均明显升高（P＜0.05）；中药各剂量组与模型组同时间点NF-κB、H-FABP蛋白表达比较差异也有统计学意义（P＜0.05）；中药不同组间对比，剂量越高，心肌组织NF-κB 、H-FABP蛋白表达下调越显著（P＜0.05）。见表2。

表2 各组心肌组织NF-κB、H-FABP蛋白表达水平比较（）

表2 各组心肌组织NF-κB、H-FABP蛋白表达水平比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05

指标 时间 只数 正常组 假手术组 模型组 低剂量组 中剂量组 高剂量组NF-κB术前 5 1.01±0.02 1.02±0.03 1.01±0.04 1.01±0.02 1.03±0.04 1.04±0.03术后 24h 5 1.03±0.03 1.05±0.06 3.18±0.21a 2.74±0.17ab 2.16±0.12ab 1.76±0.15abc术后 48h 5 1.05±0.02 1.03±0.05 2.59±0.22a 1.92±0.21ab 1.47±0.15ab 1.25±0.11bc术后 72h 5 1.04±0.03 1.10±0.12 2.11±0.17a 1.66±0.14 ab 1.22±0.08b 1.11±0.05bc H-FABP术前 5 1.54±0.12 1.52±0.13 1.53±0.11 1.52±0.10 1.55±0.12 1.57±0.13术后 24h 5 1.55±0.13 1.63±0.16 3.69±0.26a 3.02±0.21ab 2.95±0.20ab 2.46±0.18abc术后 48h 5 1.52±0.11 1.59±0.15 3.35±0.22a 2.74±0.18ab 2.57±0.18ab 2.14±0.17 abc术后 72h 5 1.55±0.14 1.62±0.16 2.71±0.14a 2.12±0.13ab 1.85±0.15b 1.66±0.14bc

4 各组心肌组织TLR-4 mRNA 表达比较

与正常组比较，模型组和中药各剂量组心肌TLR-4mRNA表达均明显升高（P＜0.01）；随着时间的延长，TLR-4mRNA表达下降，与模型组比较，中药各剂量组TLR-4 mRNA表达下降明显，剂量越高，降低的越明显（P＜0.01 或P＜0.05）。见表 3。

表3 各组心肌组织TLR-4 mRNA 表达比较（）

表3 各组心肌组织TLR-4 mRNA 表达比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01，与低剂量组比较，dP＜0.01，与中剂量组比，eP＜0.05.

时间 只数 正常组 假手术组 模型组 低剂量组 中剂量组 高剂量组术前 5 0.96±0.14 1.06±0.19 1.03±0.18 1.02±0.16 1.06±0.15 1.04±0.12术后 24h 5 1.01±0.13 1.07±0.18 34.66±6.19a 26.96±4.74ab 19.81±4.17ac 11.74±3.18acde术后 48h 5 0.98±0.15 0.96±0.16 22.89±4.62a 16.73±3.63ab 9.75±2.21ac 4.37±1.08acde术后 72h 5 1.02±0.15 0.97±0.15 14.62±3.41a 7.56±1.29 ab 4.63±1.59ac 1.79±0.45cde

讨 论

脓毒症的本质是感染诱发的器官功能障碍，其中心肌抑制尤为常见，其诱发的严重心衰是导致脓毒症患者死亡的重要原因[13]。炎症反应被认为是脓毒症心肌抑制的主要发病机制之一[14]。TNF-ɑ、IL-6是全身炎症时候细胞分泌的重要炎症介质，并且在目前的相关动物实验研究中，发现TNF-ɑ可以促进心肌炎性改变以及心肌细胞的凋亡从而引起心脏功能障碍[15]。H-FABP是诊断超早期心肌损伤的敏感标志物，其特异性高[16]。研究发现，脓毒症发生后1h 患者血清H-FABP水平已普遍升高，其升高程度与脓毒症死亡率呈正相关[17]。TLRs 是一类广泛存在于血细胞、淋巴组织和心肝肾脑等重要脏器细胞膜上的固有免疫受体，可以介导宿主的免疫应答反应[18]。其中TLR4是识别革兰阴性菌细胞外壁脂多糖成分的主要受体，并通过相关的信号通路激活NF-κB，活化的NF-κB启动众多炎症因子包括IL-6、TNF-α等的表达上调，而导致炎症信号进一步扩大，从而加重心脏损伤。

本研究发现，在通过CLP法诱导制造动物模型后，模型组及各中药治疗组的TNF-ɑ、IL-6的水平达均明显升高，并在24h时到最高水平，其后开始出现下降趋势，且同时期NF-κB 和H-FABP蛋白表达水平及TLR4基因表达情况也在造模成功后24h达到最高峰，并随着时间的延长逐渐下降，而正常组及假手术组心肌组织TNF-ɑ、IL-6水平并没有升高，而且同时NF-κB 和H-FABP蛋白表达及TLR4基因表达情况也未出现明显变化，证明了出现全身炎症反应时，心肌细胞会受到抑制并出现损伤，该结果与国内相关研究结果相一致[19-20]。

脓毒症属于中医学外感热病的范畴，中医学认为脓毒症的基本病因病机是正虚毒损、瘀滞络脉。茯苓四逆汤由茯苓、人参、附子、甘草、干姜组成，具有扶正益气，温阳通络利水之功效。前期我们发现，茯苓四逆汤能抑制慢性心力衰竭患者炎症反应、改善临床症状、减轻心肌重构、提高患者生存质量[21]。本研究中，中药各组总体病死率低于模型组，且中药各组心肌细胞TNF-α、IL-6水平较模型组明显下降，其中，高剂量组作用更加明显。说明茯苓四逆汤可以抑制脓毒症大鼠的炎症反应，减少炎症因子的释放，进而改善预后。同时我们发现，中药各组心肌组织NF-κB的蛋白表达水平及TLR-4mRNA的表达水平均比模型组低，且随着中药浓度的增高差异越显著，进一步明确了茯苓四逆汤对心肌抑制的保护机制是通过抑制TLR-4介导的炎症通路实现对脓毒症心肌抑制的保护。

综上，茯苓四逆汤能减少脓毒症大鼠病死率，减轻脓毒症大鼠心肌损伤，降低心肌细胞炎症因子含量和心肌组织中NF-κB蛋白和TLR-4mRNA的表达，证实该保护作用是通过抑制 TLR4 介导的炎症反应实现的。