运用网络药理学方法探讨心痛方治疗冠心病的作用机制*

代璐，范金茹，王子焱，王荣，佘瑞宁，张超

湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410007

冠 心 病（Coronary Atherosclerotic Heart Disease，CHD），指冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏疾病[1]。报告[2]指出，目前我国冠心病患者达1100万。尽管经皮冠状动脉介入术（PCI）在基层广泛推进和发展，但冠心病的死亡率仍居高不下。大量临床研究表明[3-5]，在西医常规治疗基础上，辨证运用中药复方对改善冠心病患者症状及生存率均有较好效果。由此可知，中医与现代医学优势互补、有机结合的确可以给患者带来最大获益。

网络药理学是是基于网络观点从系统水平分析药物作用机制、发现先导化合物或新适应症、识别新药靶点等的一种新的药物研究策略[6]，其系统性、整体性与中医整体调控机体的理念相符合。因此，运用网络药理学的研究方法，从分子层面挖掘临床验之有效的中药复方治疗某种疾病的作用机制是十分可行的。

范金茹教授将冠心病分为发作期和缓解期进行论治。所制心痛方是治疗发作期属痰瘀互结气郁证的常用方剂，以“肝心同治，间者并行，甚者独行”为原则成方。目前，经过临证运用、临床研究[7]和实验室研究[8]明确心痛方治疗冠心病的临床有效性，但前阶段的研究仅发现抑制炎症反应和调节钙稳态这两条作用通路。对心痛方治疗冠心病的其他成分、靶点、通路的作用机制研究尚不系统和全面，故本文旨在通过网络药理学方法，通过构建“成分-靶点-通路”网络对心痛方治疗冠心病的机制进行系统研究，为进一步揭示心痛方的药理作用机制提供理论指导。

资料与方法

1 心痛方化合物的收集与筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台[9]（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中查找柴胡、瓜蒌、川芎、郁金、桃仁、蒲黄、白芥子、石菖蒲、甘草9味中药的有效成分信息及其药理学信息。根据药理学特性进行药物代谢动力学（ADME）筛选，设置生物利用度（OB）≥20%，类药性（DL）≥0.1。在TCMSP中未检索到九香虫的化学成分，在“中国知网”（CNKI）及PubMed中以“九香虫化学成分”进行检索，获得九香虫的主要化学成分及化学结构式。

2 心痛方靶点的预测与标准化命名

在TCMSP中找出心痛方中药物（除九香虫外）有效成分对应的靶点信息，并利用SwissTargetPrediction服 务 器[10]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进行补充。在 Uniprot网站（https：// uniprot.org/）输入靶点蛋白并限定“Review”“Human”检索，对结果进行标准化处理，并获得官方使用标签（Gene Symbol）。通过ChemDraw19.0作图软件画出九香虫各成分的化学结构，运用SwissTargetPrediction进行ADME筛选，最后将筛选完的成分进行靶点预测，获取官方名称（commom name）。

3 冠心病靶点的收集

在 OMIM 数 据库（https：//omim.org/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、DrugBank 数据库（https：//go.drugbank.com/）中检索冠心病疾病靶点。其中对DrugBank数据库中获取的靶点进行官方标准化命名；GeneCards数据库通过Gifts算法[11-12]，可以算出冠心病与靶点的相关度，根据算出的相关度，选取Relevance score≥30的靶点为冠心病靶点。对三个数据库中的靶点信息进行整合、去重后，获得冠心病相关靶点。

4 冠心病靶点与心痛方靶点的映射

将获得的心痛方药物靶点与冠心病靶点导入VENNY2.1.0[13]（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）进行映射，得到疾病与药物的共同靶点，绘制韦恩图。用 Cytoscape3.7.2软件[14]进行可视化处理，构建药物-化合物-疾病-靶点相互作用网络图，根据拓扑学相关参数进行分析，获得心痛方治疗冠心病的核心有效成分。

5 心痛方对冠心病作用靶点的PPI网络的构建及核心靶点的分析

将疾病与药物的共同靶点导入String数据库[15]（https：//string-db.org/），绘制心痛方治疗冠心病的蛋白-蛋白互相作用网络图（PPI）。运用Cytoscape3.7.2对蛋白网络结构进行可视化处理。根据节点自由度大于平均节点自由度进行拓扑学分析，获得心痛方治疗冠心病的核心靶点。

6 GO富集分析和KEGG通路注释分析

为了进一步明确靶点蛋白的生物学功能及参与的生物学通路，运用 Metascape数据库[16]（https：//metascape.org/）对心痛方治疗冠心病的核心靶点进行基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路注释分析，其中GO富集分析主要包括细胞组分、生物进程、分子功能三部分，并对富集分析结果进行可视化处理。

结 果

1 心痛方的有效成分

TCMSP数据库中检索结果显示，共获得心痛方中药物（除九香虫外）的有效成分共1375个。将1375个有效成分根据OB≥20%，DL≥0.1进行ADME筛选后，获得有效成分417个。其中柴胡56个、瓜蒌28个、川芎44个、郁金79个、桃仁33个、蒲黄11个、白芥子9个、石菖蒲32个、甘草125个。其中有8个为柴胡、蒲黄、石菖蒲、桃仁、瓜蒌、川芎、郁金、甘草的共有成分。在中国知网中以“九香虫”检索，查找九香虫成分相关文献[17-18]，显示其主要成分共有75个，经ADME筛选后获得有效成分26个。见表1。

表1 8味药物共有成分

2 心痛方作用靶点

根据TCMSP数据库中有效成分靶点信息，并结合SwissTargetPrediction网站在线靶标垂钓，共获得心痛方有效成分作用的靶点信息268个。将获得靶点蛋白导入Uniprot进行标准化命名，得到其对应的Gene Symbol。

3 冠心病靶点的获取

在3个数据库中检索冠心病疾病靶点，OMIM数据库检索出548个、GeneCards数据库453个、Drug-Bank数据库35个，进行整合、去重后获得冠心病靶点988个。与药物靶点进行映射，获得心痛方与冠心病共同作用靶点91个，绘制韦恩图。见图1。

图1 心痛方靶点与冠心病靶点韦恩图

4 构建药物-成分-疾病-靶点网络图

将所筛选出的基因与其化合物相对应，并以“中药拼音首字母+数字” 对每一味中药的化合物进行编号（如：柴胡MOL001645编号为CH1，药物共有成分以“S+数字”编号），构建网络文件及属性文件，通过Cytoscape3.7.2软件绘制药物-成分-疾病-靶点网络图。本网络由196个节点、621条边构成，其中节点表示冠心病、中药复方药物、成分、靶点基因，边表示药物、成分、疾病、靶点之间的相互联系。根据“中介中心性”（Betweenness Centrality）进行拓扑学分析，大于Betweenness Centrality平均值0.00568的成分有18个，在Excel中按降序排列，其中排名前十的为：S3、S6、CX2、JXC1、S2、S7、TR9、TR16、JZ1、TR12。由结果可推测花生四烯酸、山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、异鼠李素、柚皮苷、杨梅酮等可能是心痛方治疗冠心病的主要有效成分。见表2，图2。

表2 心痛方治疗冠心病的核心成分

图2 药物-成分-疾病-靶点网络

5 心痛方作用于冠心病的靶点PPI网络图

将2.3获得的91个心痛方与冠心病共同作用靶点导入String数据库，构建心痛方治疗冠心病的蛋白-蛋白互相作用（PPI）网络，保存PPI网络的tsv文件。在Cytoscape3.7.2软件中，运用NetworkAnalyzer工具计算出tsv文件所构建网络的属性值，根据Degree值（Degree值表示节点所发出的边数，其数值越大，表示该节点在网络中越重要）的大小进行网络可视化。以节点自由度大于平均节点自由度进行拓扑学分析，共筛选出46个核心靶点，其中Degree最大45，最小26。排名前十的靶点基因为IL6、AKT1、TNF、VEGFA、CCL2、IL1B、EGF、CXCL8、MMP9、NOS3。

将46个核心靶点导入String数据库，设置条件minimum required interaction score：highest confidence（0.9），余保持默认设置，构建核心靶点PPI网络图。本网络包括46个节点、171条边，节点的平均度值：7.43，平均聚类系数：0.517。见图 3、图4。

图3 心痛方与冠心病交集靶点PPI

图4 核心靶点蛋白PPI网络

6 GO分析和KEGG分析

运用Metascape数据库，设置物种为H.sapiens，对 46个核心靶点进行基因功能富集分析和通路注释分析。

6.1 GO分析 根据分析结果，获得生物过程（Biological Processes，BP）657个、细 胞 组 分（Cellular Components，CC）33个、分子功能（Molecular Functions，MF）68 个（P＜0.01，FDR＜0.01）（表 2）。运用在线作图工具微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）对部分结果进行可视化处理。其中，生物过程涉及：白细胞的迁移、细胞黏附的调节、细胞分化的负调控、炎症反应的调节、对氧化应激的反应等；细胞组分包括：脂筏、血小板α颗粒、细胞外基质、细胞质的核周区域、早期内体、RNA聚合酶II转录因子复合物、粘附连接、质膜的外侧、细胞质囊泡膜；分子功能主要有：细胞因子受体结合、磷酸酶结合、整合素结合、一氧化氮合酶调节活性、肿瘤坏死因子受体超家族结合、羧酸结合、血红素结合、肝素结合、金属内肽酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、趋化因子受体结合、激酶调节活性。根据以上三部分，可以推测心痛方具有多途径、多功能的作用。

6.2 KEGG分析 为了进一步探析核心靶基因的具体作用通路，将核心靶点输入Metascape数据库进行KEGG通路注释，以P＜0.01进行筛选，共获得冠心病相关通路245条。主要包括：液体剪切应力与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶（Akt）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、节点样受体（NOD-LIKE）信号通路、JAK-STAT信号通路、甲状腺激素信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、ErbB信号通路、toll样受体信号通路等。选取其中24条与冠心病相关通路进行可视化（图5），其中X轴代表富集因子（Rich factor），Y轴代表通路，气泡的面积代表富集在该通路上的基因数目，气泡越大表示富集在该通路上的基因越多，气泡颜色代表P值。共有41个基因富集在这24条通路上，反向查找靶基因所对应的有效成分，通过Cytoscape3.7.2软件进行可视化，构建成分-靶点-通路网络图（图6）。可推测心痛方治疗冠心病是多通路作用的结果。

图5 GO富集分析饼状图

图6 GO富集分析部分结果柱状图

图7 心痛方作用靶点KEGG富集分析气泡图

图8 成分-靶点-通路网络图

讨 论

冠心病，中医称为“胸痹心痛”。古今医家认为痰浊、瘀血与胸痹的发生密切相关[19]。《血证论》有言：“血瘀既久，亦能化为痰水”、王孟英指出“痰饮者，本水谷之悍气……初则气滞以停饮，继则饮蟠而气阻，气既阻痹，血亦愆其行度，积以为瘀。”由此可见，痰瘀之间又可互相转化，互为因果，若二者共同黏附于脉道，阻碍气血濡养心肌，则发为心痛之症。“肝心同治”源于全国名中医王行宽教授提出的“心病治肝”理论[20]，《明医杂著》提出“肝气滞则心气乏”、“肝气通则心气和”，范教授在总结王老的学术经验基础上，结合中医“痰瘀理论”，以“甚者独行”为原则，立疏肝豁痰化瘀之法，研制心痛方[21]。方中柴胡行气疏肝，郁金、川芎活血化瘀，兼能“搜肝气”，瓜蒌清痰热又能“疏肝郁”，配以化瘀止痛之桃仁、蒲黄，祛痰浊之石菖蒲、白芥子以增强除痰瘀实邪之力，佐以虫类药物九香虫，性辛香走窜，擅通走脉络，搜络剔邪而又不伤正气。全方相配，肝气既顺，痰瘀则可顺势而化，实邪得除，肝气便无郁滞之理，心肝同治，母子相安。

本研究通过数据库检索，获得心痛方治疗冠心病的有效成分417个。构建中药调控网络，根据“Betweenness Centrality”进行筛选、排序后，推测花生四烯酸、山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、异鼠李素、柚皮苷、杨梅酮、豆甾醇等可能为心痛方治疗冠心病的主要有效化合物。花生四烯酸作为一种多不饱和脂肪酸，可以通过抑制代谢产物的生成途径抑制促炎症因子的表达，起到抗炎和保护血管内皮的作用[22]。在冠心病病程中，大量氧自由基是心肌细胞损伤的标志，心肌细胞的损伤伴随着细胞凋亡的发生。黄酮类化合物山奈酚、槲皮素、杨梅酮具有抗氧化、清除氧自由基、抗心肌细胞凋亡的作用[23-24]。柚皮苷属于二氢黄酮类化合物，具有抗缺血、抗氧化、抗炎等作用，其含量与降低心血管病的风险相关[25]。Huang等[26]报导，柚皮苷还可以通过降低caspase-3和caspase-9的活性，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而预防心肌细胞的凋亡。研究指出[27]，异鼠李素可通过抑制动脉血管平滑肌细胞胶原合成起到抗动脉粥样硬化的作用。

通过构建心痛方治疗冠心病靶点PPI网络，根据Dgree值进行排序，排名前十的靶点基因为IL6、AKT1、TNF、VEGFA、CCL2、IL1β、EGF、CXCL8、MMP9、NOS3。动脉粥样硬化（AS）血栓形成的过程主要涉及炎症反应和脂质在血管内壁的沉积两方面[28]。血管内皮损伤后，由内皮细胞分泌的黏附因子介导淋巴细胞、单核细胞与内皮细胞黏附，迁移至血管内皮下变为组织巨噬细胞，巨噬细胞触发IL1β、IL6、TNF等炎症因子的表达，导致平滑肌细胞增殖，斑块进展[29]。TNF中由巨噬细胞产生的TNF-α可以通过对内皮产生毒副作用，引起血管内皮损伤、促进黏附分子的表达，使巨噬细胞产生更多的TNF-α，增加斑块的易损性[30]。另一方面，血管内皮细胞分泌的趋化因子也是介导细胞黏附的重要因素之一。CCL2、CXCL8属于CXC类趋化因子。这类趋化因子可以通过活化血小板，加速血小板的聚集、黏附和释放，加剧AS进程、血栓形成[31]。

通过KEGG富集分析推测本方治疗冠心病可能是通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、液体剪切应力与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶（Akt）信号通路、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、节点样受体（NOD-LIKE）信号通路、细胞凋亡、甲状腺激素信号通路发挥作用。

综上所述，心痛方治疗冠心病是多成分、多靶点、多途径的，与单体药物相比较，复方作用更为全面、疗效更加稳定。既往实验研究表明，心痛方主要通过抑制炎症因子的释放、抑制黏附分子的表达、调节Ca2+稳态等途径干预冠心病粥样硬化的发生、变化。与本研究推测的作用靶点、生物过程和作用通路基本相符。除此之外，本研究还推测出心痛方治疗冠心病还可能与细胞凋亡、MAPK信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路等相关。可以此为理论基础进行下一步的实验研究。