配有固定波长紫外检测器的毛细管电泳仪计量检定问题及分析

赵新颖 赵少雷 丁晓静 赵海波* 林 青 袁 騉

(1.北京电子科技职业学院，北京 100176；2.北京市计量检测科学研究院，北京 100012；3.北京市疾病预防控制中心，北京 100013)

毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)是以微米级内径的石英毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的分离技术。凭借分离模式多、分析速度快、分离柱效高、样品和试剂用量省、自动化程度高等最基本和最高效的优势，CE在食品、环境、尤其是生物医药方面得到广泛应用，美国、英国、俄罗斯以及我国《药典》中均有相关方法收录[1, 2]。随着CE技术潜能的不断发挥，我国生产毛细管电泳仪的厂家已近40家[3]，用户对毛细管电泳仪的计量溯源需求也日益增加。毛细管电泳仪可依据《毛细管电泳仪检定规程(JJG 964-2001)》[4](简称：规程)进行检定/校准，共需计量15个项目。该规程自2001年10月1日实施至今已近20年，与当前商品化的毛细管电泳仪有一些不匹配之处，影响了规程的推广和使用。本文针对这些问题，以CE理论为基础，以实验结果为依据，对配有固定波长紫外检测器的毛细管电泳仪(CE-UV)的中心波长误差、滤光片半宽度(半峰宽)、静态基线漂移、基线噪声、检测限、定性和定量测量重复性共计7个项目的数据进行了分析讨论。对产生的问题尝试了方法改进，为此类毛细管电泳仪的计量检定/校准及规程修订提供了参考。

1 仪器和试剂

两台P/ACETMMDQ型、1台P/ACETMMDQ Plus型、1台PA800 Plus型毛细管电泳仪，均配有固定波长紫外检测器(标示波长：200 nm、214 nm、230 nm、254 nm、280 nm)，工作站；体积计算：Beckman CE Expert，Lambda 950型紫外可见近红外分光光度计；PHS-3C型pH计；EX225D型天平；未涂层石英毛细管。

维生素B6纯度标准物质(GBW 15003, C8H11O3N·HCl，Vitamin B6， VB6)外购；其他试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。

2 实验条件

20 mmol/L Na2HPO4水溶液：按规程附录A.4配制，室温放置1h后使用，20℃保存，有效期5天。

维生素B6标准物质溶液：按规程附录A.3配制质量浓度为1.0×10-4g/mL的样品溶液，溶剂分别为20 mmol/L Na2HPO4溶液和水。室温放置1 h后使用，每次使用前新鲜配制。

电泳参数(根据需要设置)：样品盘温度20℃;分离温度20℃;检测波长254 nm;分离电压+10 kV;压力进样1.0 psi × 5 sec。

毛细管的处理：新毛细管使用前依次用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH、水和20 mmol/L Na2HPO4水溶液20psi冲洗10 min，重复两次。每次使用前依次用0.1M NaOH、水和20 mmol/L Na2HPO4水溶液20psi冲洗5 min。使用后依次用0.1 mol/L NaOH、水和空气20psi冲洗3 min。间隔进样时，用20 mmol/L Na2HPO4水溶液20 psi冲洗3 min。

3 结果和讨论

3.1 固定波长紫外检测器中心波长和半宽度的检定

取出毛细管电泳仪紫外检测器配置的滤光片，按规程中指定的《干涉滤光片(JJG 812-1993)》[5]检测中心波长(峰值波长)和半峰宽，标示波长和测得的中心波长之差即为中心波长误差。实验结果表明，3种型号的4台毛细管电泳仪配置的17块滤光片中，标示波长200 nm、214 nm、230 nm、254 nm和280 nm滤光片各有1块中心波长误差大于规程中规定的 ± 2nm；3块200 nm和2块214 nm滤光片的半峰宽大于规程中规定的15 nm(表1)。针对上述情况，建议更换符合要求的滤光片，确保实验数据的准确性。

表1 3种型号的4台毛细管电泳仪配置的17块滤光片检定结果

3.2 静态基线漂移和基线噪声的检定

规程对静态基线漂移和基线噪声检定做出了描述，实际上动态基线漂移和动态短期噪声更能反映毛细管电泳仪运行时的综合状态。本文在毛细管电泳仪运行状态下，对上述参数进行采集。根据《高效液相色谱仪(GBT26792-2019)》[6]中4.5.1.3.2所示计算方法，得到动态基线漂移值6.96 × 10-4AU/h(图1A)；选取基线中噪声较大的5 min，以1 min为界画绘制平行包络线，其宽度平均值2.6 × 10-5AU(n = 5)为动态短期基线噪声(图1B)；二者均符合规程要求。

图1 动态基线漂移(A)和检测器噪声(B)测定的电泳图图1B(× 10-5 AU)a：3.1； b：0.3；c：2.5；d：3.6；e：3.3(电泳条件见表2改进方法部分)

3.3 检测限、定性和定量测量重复性检定

3.3.1不明确参数

规程中一些重要参数不明确对检定造成了操作困难。(1)毛细管材质和规格。现用商品化毛细管有未涂层以及多种涂层的石英毛细管，甚至有聚四氟乙烯材质的毛细管，规程中未提及。此外，规程中只提到75 μm × 40 cm，未指明40 cm是毛细管的有效长度还是总长度。(2)毛细管的处理方法。毛细管的活化和进样前的清洗程序是影响CE实验重复性的重要因素，规程中未提及处理方法。(3)溶液保存条件和有效期。例如，20 mmol/L Na2HPO4水溶液为碱性，易吸收空气中的CO2而导致pH发生变化，影响定性定量测量的重复性，规程中没有对所使用溶液的保存期和有效期进行说明。(4)进样体积。CE的进样体积一般为纳升级，是决定检测限的重要因素，规程中仅给出“20 cm高差持续180 sec”，没有折算到纳升。

3.3.2不合理参数

规程中的不合理参数造成了实验重复和重现困难。(1)标准物质溶液不稳定。VB6不耐高温，遇碱易破坏[7]，在规程选定的20 mmol/L Na2HPO4水溶液(pH约为9.30)中不稳定，导致定量结果重复性不能满足要求。(2)背景电解质pH不在最佳缓冲范围内。CE分离必须在缓冲溶液中进行，以得到较好的定性和定量重复性[2]。Na2HPO4的pKa2为7.20，pKa3为12.36，理论上的最佳缓冲范围应为pKa± 1，即 6.20

3.3.3方法改进

使用P/ACETMMDQ Plus型毛细管电泳仪按规程操作，VB6为1.0 × 10-4g/mL时，电泳峰不尖锐，出现平头峰(图2A)，这可能是进样量过大造成的过载现象；VB6为1.0 × 10-5g/mL时，电泳峰仍然不尖锐，出现圆头峰和分叉峰(图2C)，这可能是样品介质电导值和背景电解质电导值无差异造成的；VB6为2.0×10-6g/mL时，无法获得积分，检测线无法满足要求(图2E)。总之，该条件下基线噪音过高，尽管定性重复性符合要求，但峰面积和峰高的定量重复性、检测限都无法达到要求(表2)，仪器性能被低估。

表2 规程方法和改进方法参数与指标对比

通过优化毛细管内径和长度、样品介质、分离电压等参数，VB6为1.0 × 10-4g/mL时，峰型变尖锐，但峰面积和峰高变化过大(图2B)，也可能是过载造成的；VB6为1.0 × 10-5g/mL时，峰型尖锐、对称性好，定性和定量重复性都能获得符合要求的结果(图2D)；VB6为2.0 × 10-6g/mL时，检测限得到大幅度提升(图2F)，这也证明了构建背景电解质与样品介质电导差异的重要性。事实上，改进之后的方法依然不够完善，还需要根据CE原理进行筛选和优化，从而更加科学、客观地评价仪器性能。

图2 规程方法(A)和改进方法(B)的电泳图A、C、E：VB6的20 mmol/L Na2HPO4水溶液； B、D、F：VB6的水溶液

4 小结

《毛细管电泳仪检定规程(JJG 964- 2001)》中不明确与不合理的参数限制了规程的使用，尤其是对定量重复性和检测限的影响极大。经验丰富的使用者能够通过方法优化克服，而初学者和经验不足的使用者，在使用该规程时存在较大困难。因此，建议规程及时进行修订，选用更科学合理的CE方法，并对其进行细化，以便更好地满足检定和校准的需求，促进CE技术的广泛应用，保障我国CE仪器量值溯源高质量发展。

连续可调波长紫外检测器毛细管电泳仪的检定将在下篇文章详述。