恒温扩增芯片法对住院患者下呼吸道感染病原谱分析

王克杰

(民航总医院，北京 100123)

下呼吸道感染(Lower Respiratory Tract Infections，LRTI)是一种高治病率及高死亡率的疾病之一，世界卫生组织2013年发布的统计结果显示，下呼吸道感染(5.9%)位列十大死因第3位，位列第4位的慢性阻塞性肺病(5.4%)病死也多和感染相关。研究显示，住院患者是LRTI死亡的主要人群，死亡率高达23%[1]，因此住院LRTI患者的诊断和治疗应受到重视。LRTI主要致病菌为革兰阴性杆菌[2]。近年来，随着病原诊断技术的提高，如核酸检测和血清学分析等技术，非典型致病菌所占比例不断提高[3,4]。因此，对下呼吸道感染的病原菌进行分析总结，可为呼吸道疾病的预防与治疗提供病原菌证据，加深对呼吸道细菌感染的认识，以便能更好地进行临床针对性治疗。目前细菌培养和血清学检测是下呼吸道感染的主要实验室诊断方法，而现阶段的诊断技术操作繁琐，低效，阳性检出率仅有30%～40%[5]，获得结果周期较长，每次只能鉴定一种病原体，本研究采用恒温扩增和微流控碟式芯片相结合的技术，对1份标本同时进行13种下呼吸道病原体靶基因进行扩增和检测，分析呼吸道感染细菌病原谱组成情况及流行病学特征，为呼吸道感染的抗菌治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2018～2020年呼吸科病房送检的痰标本，其中自然咳痰2581份，气道下痰222例，气管镜引痰77例，肺泡灌洗液11例。男性1803例，女性1088例，年龄14～98岁，平均年龄70.42±15.925岁。临床症状主要为发热、咳嗽咳痰，伴或不伴胸痛及呼吸困难，查体呼吸音粗糙伴或不伴干/湿性哕音，胸部x线片或胸部cT扫描等影像学提示下呼吸道感染。

1.2 仪器与试剂

呼吸道病原菌核酸检测试剂盒 ( 恒温扩增芯片法 ) 购于生物公司。检测采用 RTisochipTM-A 恒温扩增微流控芯片核酸分析仪； II 级 B2 型生物安全柜；干式恒温加热器；台式高速低温冷冻离心机和微量移液器 。

1.3 恒温扩增芯片法检测病原体

1.3.1样本前处理

向标本中加入等体积 10% NaOH，充分震荡，室温液化大于30 min，取 1 mL 液化后的样品转移到1.5 mL 离心管中，12 000 rpm 离心 5 min，弃上清。再向离心管中加入 1 mL 洗液，充分震荡后12 000 rpm离心 5 min，弃上清。最后，向离心管中加入 100 μL 核酸提取液，用移液器吹吸沉淀，将液体和沉淀一起转移到核酸提取管中，震荡10 min。 95℃ 加热 5 min，10 000 rpm 离心1min，待用。

1.3.2 配置恒温扩增反应体系

吸取融化离心后的20μL扩增试剂到200μL空离心管，加入已提纯好的34.5μL被检核酸样品，轻摇混合均匀，瞬时离心至管底。

1.3.3芯片加样

取出芯片恢复室温，用移液器吸取50μL上述配置好的核酸扩增反应体系，从芯片进口加入到主通道中，将加样后的芯片固定低速离心机上，以6000rpm离心30s后取下。

1.3.4核酸扩增

用恒温扩增微流控芯片核酸分析仪和相应软件进行反应和实时荧光分析，在具有链置换功能的聚合酶作用下，扩增阳性的样本会产生类似“ S”形扩增曲线，一步完成对13种病原体基因的扩增和检测。

1.3.5结果判读

试剂盒采用ROC法计算得到13种待检病原的阳性判断值，将各病原指标的参考值整合至判断软件中，由软件对样品检测结果进行自动判读。当检测指标的扩增时间值≤ 该病原指标的参考值时判读为阳性。每个芯片内均设1个阳性质控和9个阴性质控。

质控结果正常 ( 阴性和阳性均正常 )，表明本次检测结果有效，若任一结果错误，则判定本次样品检测无效，需要进行复检，或重新送检。

1.4 统计学方法

应用 SPSS 19.0统计软件，计量资料采用均数±标准差表示，计数资料采用例数和百分比表示，行卡方检验(组间比较采用卡方分割检验)，P <0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芯片法病原体检测结果

病原体的总阳性率为 59.88%(1731/2891)，13种病原体均检测到，阳性率依次为：耐甲氧西林葡萄球菌33.9%，铜绿假单胞菌11.4%，肺炎克雷伯菌10.9%，鲍曼不动杆菌9.9%，金黄色葡萄球菌9.2%，流感嗜血杆菌9.1%，嗜麦芽窄食单胞菌5.7%，肺炎链球菌4.7%，肺炎支原体2.9%，肺炎衣原体2.9%，结核分支杆菌复合群1.9%，嗜肺军团菌1例。其中，单一病原感染占34.5%(998/2891)，流感嗜血杆菌和肺炎支原体以单一感染常见，混合感染占25.4%(733/2891)，以耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌多见，其中2种菌混合感染占14.1%(407/2891)，3种菌感染6.8%(197/2891)，4种菌感染2.9%(84/2891)，5种菌感染1.0%(29/2891)，6种菌感染0.5%(14/2891)，7种菌感染0.1%(2/2891)。见表1。

表1 病原体分布情况[n(%)]

续表1

2.2 病原菌检出影响因素

2.2.1不同性别病原菌感染分布情况

2891例住院患者中，男性1803例，阳性率66.8%，女性1088例，阳性率33.2%，男性阳性率高于女性，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2.2不同年龄分组病原菌感染分布情况

研究中，将14～45岁归为青年组，46～69岁为中年组，>69岁为老年组。检测后可见：肺炎链球菌、结核分枝杆菌复合群、嗜肺军团菌在不同的年龄分组上阳性检出率无差异(P>0.05)；肺炎衣原体、铜绿假单胞菌在青年中的感染与中年和老年不同，差异有统计学意义(P<0.05)；流感嗜血杆菌在中年组检出率高于青年和老年组，差异有统计学意义(P<0.05)；金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌以老年人感染明显，对比青年和中年组差异有统计学意义；耐甲氧西林葡萄球菌、鲍曼不动杆菌与年龄正相关，年龄越大越容易感染；肺炎支原体与年龄负相关，年龄越小越容易感染。见表2。

表2 不同年龄病原体检出分布(n)

2.2.3不同标本类型病原菌感染分布情况

送检标本中：自然咳痰2582份，检出阳性1480份，气道下痰222份检出阳性191份，气道下痰、气管镜引痰的阳性检出高于自然咳痰、肺泡灌洗液，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同的标本类型病原体检出率比较

2.2.4不同季节病原菌感染分布情况

肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、结核分支杆菌复合群和嗜肺军团菌四季检出无差异(P>0.05)；耐甲氧西林葡萄球菌四季都有高检出率；春季流感嗜血杆菌多见；夏季以鲍曼不动杆菌多见；秋季以肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌多见；冬季以流感嗜血杆菌多见。见表4。

表4 不同季节病原体检出分布(n)

3 讨论

感染性疾病以呼吸道感染为主，急性上呼吸道感染 90% 以上由病毒引起，急性下呼吸道感染常为细菌和病毒感染。引起下呼吸道感染的常见病原体包括大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、克雷伯氏菌属、不动杆菌属、金黄色葡萄球菌、肠球菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、溶血链球菌和变形杆菌[6]。近年来，成人肺炎支原体感染报道增加，有资料显示在成人社区获得性肺炎( CAP)中， 肺炎支原体已经成为感染率居首位的非典型病原体[7]。临床上治疗的重点在于及早、准确发现致病菌及其耐药性，因此准确和快速诊断病原体对医生指导患者临床用药有重要意义。

环介导等温扩增技术以其灵敏度高，特异性强、对仪器设备要求低的特点得到广泛的应用，依据其原理设计的核酸检测试剂盒已在国内使用，与培养法和血清学法比较，有较好的一致性，更高的阳性检出率和特异性[8-10]。呼吸道病原菌核酸检测试剂盒利用恒温扩增芯片技术及高速数字信号处理技术相结合，使检测方法简单快速、试剂耗量低、自动化程度高，提高了检测敏感性，具备了对呼吸道感染性疾病的快速诊断能力。

此次研究结果显示住院患者呼吸道病原体感染阳性率为59.88%，13种病原体均检测到，检出率较高的依次为耐甲氧西林葡萄球菌33.9%、铜绿假单胞菌11.4%、肺炎克雷伯菌10.9%、鲍曼不动杆菌9.9%、金黄色葡萄球菌9.2%、流感嗜血杆菌9.1%，与李艳燕等[11]的研究报道：恒温扩增芯片法检出病原体总体阳性率为58.27%，其中鲍曼不动杆菌占21.05%、耐甲氧西林葡萄球菌20.30%、铜绿假单胞菌12.03%，基本相同。 也基本相同与陈愉生等[12]的研究报道：下呼吸道感染的病原菌主要是铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌和肺炎链球菌。研究结果显示耐甲氧西林葡萄球菌阳性率较高，可能因为该试剂盒耐甲氧西林葡萄球菌指标由mecA基因指示，理论上不能排除为其他菌所携带，也可能存在院内感染，与人工机械通气、留置导管等有创操作有关，也与病人条件，抗生物使用情况有关。本次检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)218例，占耐甲氧西林感染的22.2%(218 /980)，占金黄色葡萄球菌的81.6%(218 /267)，高于国内其他研究[13]。可能由于本次入选住院患者多数为>69岁老年人，且长期住院，伴随基础疾病多，耐药菌株既可由感染病人带入医院，也可因滥用抗生素在医院内产生，也可因检测方法不同，MRSA的检出率受孵育温度、时间、培养基的pH和NaCl的浓度、菌液的数量等多种因素的影响，而恒温扩增芯片法灵敏度高，最低检测限为5×102拷贝/反应，阳性排除污染，阴性结果不排除低拷贝数。此外检测到1例嗜肺军团菌，由于其感染潜伏期较长、症状不典型，易导致漏诊率、误诊率，是儿童呼吸道疾病中重要致病菌[14]，在成人中少见，检出率较低[15]。本次结果提示检出革兰阴性菌(肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌，流感嗜血杆菌，大肠埃希菌)共1272例，革兰阳性菌(耐甲氧西林葡萄球菌，肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌)共1283例，检出例数基本持平，这与张波等[16]研究不同，原因可能为其入选病例为慢阻肺合并肺部感染，而本次研究入选病例不限于慢阻肺，单纯肺炎，发热也包含在内。本次还检测出56例结核分枝杆菌复合群，由于结核的培养需要特殊的培养基，条件苛刻，其检出时间长，不适用疾病的快速筛查，本次检出结核复合群也经其他PCR方法进行验证，结果一致，可见试剂盒有高准确性，可运用到病原谱的筛查。

研究结果显示病原体的分布受性别的影响，这与王帆等[17]的研究结果不一致的，可能由于研究对象并非社区患者，在一定程度上可能存在统计偏倚，导致研究内男性检出率高于女性。关于年龄对检出的影响，结果提示青年人(<45岁)多以肺炎支原体，肺炎衣原体感染多见，中年人(46～69岁)以流感嗜血杆菌多见，老年人以肺炎克雷伯感染多见，这与刘又宁等的研究结果相近[18]，而且青中年以单一感染为主，老年以混合感染为主，估计与老年人基础疾病多，使用抗生素情况关。下呼吸道送检痰液标本要求白细胞大于25/低倍视野且上皮细胞<10/低倍视野为合格痰样本，样本量不少于0.6 mL，本次将痰分为4类，其中气道下取痰和气管镜引痰的检出率明显高于自然咳痰和肺泡灌洗液，究其原因可能是气道和气管镜采痰是从肺部感染患者的下呼吸道吸取，避开了口腔和上呼吸道菌群的污染，而自然咳痰影响因素较多：咳痰的时间(晨痰、饭前饭后)，咳痰方式(深咳，浅咳)等导致低检出率，而肺泡灌洗液是采用纤维支气管镜经鼻腔插管到达感染肺段，以温生理盐水 10 mL～20 mL 经支气管镜快速注入，然后经支气管镜负压吸引，将灌洗液收集于无菌瓶内送检，本研究中只收到10例肺泡灌洗液，较其他类型的痰可以忽略不计，但是在冯利花等[20]的研究中显示，肺泡灌洗液的检出低于深部痰标本，这与本研究结果一致。本次结果还提示不同季节病原体检出不同，春季流感嗜血杆菌多见；夏季以鲍曼不动杆菌多见；秋季以肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌多见；冬季以流感嗜血杆菌多见，与冯利花等[19]在儿童下呼吸道病原体检测的研究不同，可以说明不同人群，在不同季节，病原谱分布不同。

研究的不足之处在于，没有对入选病例进行系统的疾病分型，没有对比病原体在不同疾病中分布的差异性，也没有对所检出病原体进行不同方法的对比研究。

综上所述，下呼吸道感染的病原体种类多，分布受性别，年龄，季节，标本类型，地域，患者情况，临床抗生素用药情况相关。临床上根据患者所感染的病原体对患者进行抗菌药物的治疗 ，对其治愈率没有很大的影响 ，由于临床上住院患者年龄都普遍较大 ，而且很多患者自身就伴随着一些基础性疾病 ，以致自身免疫力和抵抗力都很差 ，导致革兰阴性菌和一些易感染球菌的情况十分常见 ，而目前这些患者的致病菌耐药情况非常广泛。恒温扩增芯片试剂盒在诊断呼吸道病原体上准确性高，特异性强，重复性好，抗干扰能力强，而且其临床试验阳性符合率大于96%，阴性符合率大于99%，与培养结果一致性为67.4%，大大缩短了检出时间，为本院呼吸科的临床治疗提供准确使用抗菌药物的依据，避免临床的用药混乱 ，降低患者感染病原体出现加急加重的概率 ，也缩短患者住院时间，节约住院费用，同时降低抗菌药物耐药菌株的产生。该方法还可以推广到医院其他住院科室，甚至医院院感的普查。