基于供试液多维使用的炎可宁丸鉴别优化研究

罗晖明，聂平，丁野，程雪清，余彬彬

1.湖南省药品检验研究院（湖南药用辅料检验检测中心），湖南 长沙 410001；2.湖南省药品质量评价工程技术研究中心，湖南 长沙 410001；3.天地恒一制药股份有限公司，湖南 长沙 410331

炎可宁丸处方由黄柏、黄连、黄芩、大黄、板蓝根五味组成，可清热泻火，消炎止痢，常用于急性扁桃体炎、急性尿道感染等［1］。炎可宁丸上市后因疗效显著，被广大医务工作者和病人认可，产品销售规模逐年提高。现行质量标准YBZ1229592005-2009Z［1］包括大黄的显微特征鉴别，黄连、黄柏的化学反应鉴别，大黄的薄层色谱鉴别，以及黄芩苷的含量测定。对于薄层色谱鉴别，国家药品标准工作手册（第四版）明确要求，尽可能采取一个供试液多项多维鉴别使用［2］，以达到保护环境、节约资源、简便实用的目的。本研究重点针对这一要求，尽量共用供试液制备方法，对炎可宁丸处方各味药进行TLC法鉴别研究，助力该制剂的质量控制。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

分析天平（瑞士METTLER，AE240型）；烘箱（德国BINDER，FED 240型）；超声仪（宁波新芝，SB-12DTD型，600 W，40 KHz）；硅胶G板（德国Merck，10 cm×20 cm）；试剂均为分析纯（南京化学试剂股份有限公司）；纯化水。

1.2 材料

炎可宁丸（某企业，批号170501，180703，190102，规格：每袋装3 g）；阴性样品分别按炎可宁丸处方自行制备；对照品：盐酸黄柏碱（批号111895-201805，纯度94.9%）、盐酸小檗碱（批号110713-202015，纯度85.9%）、盐酸巴马汀（批号110732-201913，纯度85.7%）、大黄酸（批号110757-201607，纯度99.3%）、黄芩苷（批号110715-201821，纯度94.2%）、靛玉红（批号110717-201805，纯度99.6%）；对照药材：黄连（批号121752-201801）、大黄（批号120902-201912）、黄芩（批号120955-201810），以上对照物质全部购于中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 黄柏的TLC鉴别［3-6］

取4.5 g炎可宁丸，研细，加甲醇20 mL，超声30 min，滤过，取滤液10 mL浓缩至1 mL（留下其余滤液备用），作为供试品溶液。按处方称取除黄柏外的其他味药，按制备工艺处理后，同供试品溶液制备法制备阴性对照溶液。另取盐酸黄柏碱对照品，用甲醇为溶剂制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。照TLC法试验，取5 μL供试品溶液、2 μL对照品溶液，分别点在同一块硅胶G板上，将薄层板放在用氨饱和的展开缸里，用三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶4）的下层液上行展开后，喷以稀碘化铋钾试液。在与对照品色谱相应的位置上，供试品色谱显相同颜色的斑点。缺黄柏的阴性对照没有产生干扰，见图1。

图1 黄柏薄层色谱图

2.2 黄连的TLC鉴别［3,7］

取“2.1”项下的备用滤液1 mL，加在干法装柱的中性氧化铝柱（100～200目，5 g，内径1.5 cm）上，用50 mL无水乙醇洗脱，洗脱液蒸干后的残渣用1 mL无水乙醇溶解，作为供试品溶液。按处方称取除黄连、黄柏外的其他味药，按制备工艺处理后，同供试品溶液制备法制备阴性对照溶液。取0.1 g黄连对照药材，加20 mL甲醇浸泡5 min后，超声30 min，过滤，将滤液作为对照药材溶液。再取盐酸小檗碱和盐酸巴马汀对照品，分别用甲醇为溶剂，制成0.2 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。照TLC法试验，以上四种溶液各取5 μL，分别点在同一块硅胶G板上，将薄层板放在用浓氨试液预饱和20 min的展开缸里，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（6∶3∶2∶2∶1）上行展开后，365 nm下检视。在与对照药材色谱相应的位置上，供试品显四个以上相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。缺黄连、黄柏的阴性对照没有产生干扰，详见图2。

图2 黄连薄层色谱图

2.3 大黄的薄层色谱鉴别［3,8］

取“2.1”项下的备用滤液作为供试品溶液。按处方称取除大黄外的其他味药，按制备工艺处理后，同供试品溶液制备法制备阴性对照溶液。取0.1 g大黄对照药材，加20 mL甲醇浸泡5 min后，同法处理成对照药材溶液。再取大黄酸对照品，用三氯甲烷为溶剂制成l mg/mL的溶液，作为对照品溶液。照TLC法试验，吸取5～10 μL供试品溶液、5 μL对照药材溶液、5 μL对照品溶液，分别点在同一块硅胶G板上，将薄层板放在展开缸里，用石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液上行展开后，365 nm下检视。在与对照药材色谱相应的位置上，供试品显相同的橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；氨熏，日光下显相同的红色斑点。缺大黄的阴性对照没有产生干扰。详见图3。

图3 大黄薄层色谱图：A.365 nm；B.日光

2.4 黄芩的薄层色谱鉴别［3］

取“2.1”项下的备用滤液作为供试品溶液。按处方称取除黄芩外的其他味药，按制备工艺处理后，同供试品溶液制备法制备阴性对照溶液。另取1 g黄芩对照药材，加20 mL甲醇浸泡5 min后，同法处理成对照药材溶液。再取黄芩苷对照品，用甲醇为溶剂，制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。照TLC法试验，以上三种溶液各取5 μL，分别点在同一块硅胶G板上，将薄层板放在展开缸里，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）上行展开后，喷以2%三氯化铁乙醇溶液。在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，供试品显相同颜色的斑点。缺黄芩的阴性对照没有产生干扰。详见图4。

图4 黄芩薄层色谱图

2.5 板蓝根的薄层色谱鉴别［3,9-11］

取10 g炎可宁丸，研细，加水40 mL，水浴加热回流10 min，立即冷却，离心5 min（转速5 000 r/min），取上清液加热近沸，加入吲哚醌0.05 g，加热回流20 min后，加入18%盐酸溶液5 mL，再加热回流40 min，立即冷却，离心5 min（转速5 000 r/min），弃去上清液，残渣加三氯甲烷40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液加1%氢氧化钠溶液洗涤2次，20 mL/min，弃去氢氧化钠液，三氯甲烷浓缩液至1 mL，作为供试品溶液。按处方称取除板蓝根外的其他味药，按制备工艺处理后，同供试品溶液制备法制备阴性对照溶液。另取靛玉红对照品，用三氯甲烷为溶剂，制成50 μg/mL的溶液，作为对照品溶液。照TLC法试验，吸取20 μL供试品溶液、5 μL对照品溶液，分别点在同一块硅胶G板上，将薄层板放在展开缸里，用甲苯-乙酸乙酯-丙酮（5∶4∶1）上行展开。在与对照品色谱相应的位置上，供试品显相同颜色的斑点。缺板蓝根的阴性对照没有产生干扰。详见图5。

3 讨论

药品的疗效源自药品的质量，药品的质量又源自生产工艺和原材料。炎可宁丸的制备工艺比较复杂，处方中虽然只有五味药材，但却包含了大黄、黄连生粉入药、板蓝根、黄芩水提取后入药、黄柏水提醇沉后入药三条路线。目前执行的质量标准中仅仅只收载了黄柏、黄连的化学鉴别、大黄的薄层色谱鉴别，难以全面控制炎可宁丸的产品质量。

中药的质量控制研究具有阶段性和渐进性［11］。随着中医药产业的发展，中药的生产和质量以及检验标准存在的问题越来越引起人们的关注。炎可宁丸处方中各味药材的研究日趋深入，为其质量标准的提升提供了充分条件。本研究基于供试液多维使用的考虑，仅仅只取样一次，共用部分供试液即可以实现黄柏、黄连、黄芩、大黄的鉴别，大大简化了操作，提升了效率，减少了样品的消耗。

板蓝根中含有制剂中其他四味药材没有的靛玉红成分，但由于其中含量太少，而且炎可宁丸中该味药经水煎煮提取工艺致使靛玉红的提取率较低，直接利用其作为指标成分进行质量控制难度较大。但板蓝根药材中含有大量的靛苷成分，其适合水提工艺，靛苷水解后会生成氧化吲哚，而在特定条件下氧化吲哚能与吲哚醌生成靛玉红［12］，利用此线路生成的靛玉红与板蓝根自身含有的靛玉红可以在鉴别中作为指标成分对板蓝根进行控制。