牙髓血运重建对大鼠年轻恒牙影像及VEGF、NGF的影响

刘迪 史滨伟 陶冠男

目前，临床上对于年轻恒牙的治疗除了需要进行根管治疗外，亦需要促进根尖孔闭合治疗，包括：氢氧化钙根尖诱导成形术即MTA根尖屏障术等[1]。而牙髓血运重建术属于一种新型的干预方法，治疗过程中经严格的根管消毒、刺激根尖周血液进入根管及严密冠部填充，能使得牙根继续发育，影像学下多表现为牙根长度提高、根管壁增厚及根尖病变消失等[2]。同时，牙髓血运重建术的使用能使得根管中有血管化生长组织长入，能巩固手术效果。但是，牙髓血运重建术对血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、神 经 生 长 因 子（nerve growth factor，NGF）的影响研究较少。本研究以大鼠为对象，探讨牙髓血运重建术在年轻恒牙大鼠中的作用机制，报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物资料

购置3周龄大鼠20只，随机10只大鼠设为对照组，体质量60～80 g，平均（70.00±10.00）g；剩余大鼠建立大鼠年轻恒牙牙髓血运重建术的模型，设为观察组，术后3周后处死实验动物。20只大鼠均为体质量60～80 g的SPF级SD大鼠，平均（72.00±8.00）g；雌雄各半（动物合格证号：SCXX-2005-0001），所选动物均购置于实验动物房，完成大鼠的常规喂养、光照。两组一般资料差异无统计意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 仪器与设备

实验所用的仪器与设备见表1。

表1 仪器与设备

1.3 方法

建模方法为：（1）建模前准备。纳入研究的20只大鼠中的随机10只大鼠设为对照组；剩余大鼠建立大鼠年轻恒牙牙髓血运重建术的模型，设为观察组，术后3周后处死实验动物，具体建模方法如下：建模大鼠均完成腹腔麻醉，麻醉诱导时间为5～10 min；待实验翻正反射消失后，将其固定在大鼠专用的固定与口腔牵拉装置，根据建模需要，调节装置的角度，充分暴露大鼠口腔手术区域、下颌磨牙区域，并将其放置在手术区域，以获得清晰的手术视野；（2）年轻恒牙牙髓血运重建术[3]。手术前对大鼠进行常规消毒，待麻醉生效后进行铺巾；将大鼠放置小棉卷隔湿，对大鼠所有操作均严格遵循无菌操作；借助高速不锈钢球钻从大鼠下颌第一磨牙的管部完成开髓，借助生理盐水常规完成根管腔的冲洗，并将K锉进行处理干预，保证K锉高于根尖孔，刺激根尖组织出血并达到根管口水平部位，待血块凝结后，借助MTA完成凝血块面的覆盖；利用玻璃水门汀（GIC）完成冠部充填[4]。术后3周后处死实验动物，并完成下颌骨分离，并完成组织学、影像学观察。

1.4 观察指标

（1）影像学观察。两组干预完毕后使用X线成像系统对标本逐个进行断层扫描成像；（2）测定VEGF、NGF mRNA。步骤为：①取上述分离的组织标本，向标本中加入Trizol 500 μL，充分混合后转移到离心管1.0 mL，5 min振荡后，静置。向各组标本中加入氯仿200 μL 15 s振荡，5 min静置后15 min离心，离心速度12 000 rpm；完毕后加入预冷的乙醇（浓度75.0%）1 mL，常温下7 min干燥；经紫外分光度仪A260下测定吸光度值。②检测方法：采用实时荧光PCR法测定两组VEGF、NGF mRNA水平。根据实验需要完成PCR参数设置：30℃下10 min；42℃下30 min；99℃下5 min；5℃下5 min，合计完成循环35个，72℃下10 min延长，获得最终产物并放入1.5%琼脂凝胶电泳，β-actin为内对照，引物见表2。

表2 引物设计

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件处理，计数资料行χ2检验，用例（%）表示，计量资料行t检验，采用 （±s）表示，P＜0.05时表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组影像学结果比较

X线成像系统结果表明：观察组牙髓血运重建组大鼠下颌第一磨牙牙根尖部阴影膨大，管壁增厚，有新生高密度硬组织形成，牙根继续发育。对照组大鼠下颌第一磨牙牙体完整，根尖周围未见明显异常，牙根发育尚未完成，根管口成喇叭状，见图1。

图1 两组X线结果比较

2.2 两组VEGF、NGF mRNA比较

实时荧光PCR法结果表明：观察组大鼠牙髓血运重建术干预后VEGF、NGF mRNA水平明显高于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 两组VEGF、NGF mRNA比较（OD， ±s）

表3 两组VEGF、NGF mRNA比较（OD， ±s）

组别 例数 VEGF mRNA NGF mRNA观察组 10 3.43±0.51 1.36±0.34对照组 10 1.02±0.25 0.95±0.16 t值 - 12.418 3.450 P值 - 0.000 0.003

3 讨论

牙髓损伤修复过程中，血管生成是牙本质成功修复的前提，而血管内皮生长因子在其中发挥了重要的作用。既往研究表明[5]：人牙本质基质及牙髓组织中VEGF含量相对较少，其分泌细胞为牙髓成纤维细胞、牙本质样细胞与未分化间质细胞与巨噬细胞等。国外学者研究表明[5-7]：VEGF能强烈诱导人牙髓细胞的趋化性能，能促进细胞的增殖与分化。而NGF是在人体中发现的一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能具有良好的调节作用的生长因子，能维持交感神经与感觉神经的生存，亦可促进神经细胞的分化，其表达水平决定轴突的伸展方向，对促进大脑发育、神经系统的生长与损伤神经的再生具有良好的促进作用。既往研究表明：NGF广泛用于神经中毒、周围神经损伤、糖尿病性周围神经病变等疾病中，属于目前唯一能用于临床的神经系统蛋白因子。牙髓血运重建术属于是一种微创干预方法，最早由国外学者于2001年首次提出，并用于牙髓再生患者中，但是在年轻恒牙中

的作用研究较少。本研究中，X线成像系统结果表明：观察组牙髓血运重建组大鼠下颌第一磨牙牙根尖部阴影膨大，管壁增厚，有新生高密度硬组织形成，牙根继续发育。对照组大鼠下颌第一磨牙牙体完整，根尖周围未见明显异常，牙根发育尚未完成，根管口成喇叭状，提示牙髓血运重建术能促进年轻恒牙的治疗、修复，能获得良好的预后。牙髓血运重建术是指恒牙治疗过程中，严格的根管消毒、刺激根尖周血液进入根管与严密冠部充填，能促进牙根继续发育，从而引起根管壁增厚、根尖孔逐渐闭合及根尖病变消失。因此，牙髓血运重建术用于年轻恒牙中，能促进血管化组织长入，能提高VEGF、NGF水平及数量[8-10]。国内学者研究表明[11]：VEGF、NGF均具有促进血管新生的作用，亦可促进细胞趋化，且VEGF能促进细胞有丝分裂；而NGF利于神经细胞的存活和生长。本研究中，实时荧光PCR法结果表明：观察组大鼠牙髓血运重建术干预后VEGF、NGF mRNA水平高于对照组（P＜0.05），提示牙髓血运重建术能提高VEGF、NGF mRNA水平，能评估大鼠预后，可指导年轻恒牙的治疗。因此，年轻恒牙治疗过程中应加强VEGF、NGF水平测定，评估预后，但是本研究尚处于动物实验结果，临床使用尚需要进一步研究与探讨[12-13]。

综上所述，牙髓血运重建术用于年轻恒牙大鼠中效果理想，能提高VEGF、NGF水平，可为临床治疗提供参考依据。