高效液相色谱法测定发酵制品中苯乳酸和苯丙酮酸

◆作者：侯楠楠 谢全喜 王 梅 王 倩 鹿晓慧 周 红 谷 巍

◆单位：山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东省动物微生态制剂重点实验室

苯乳酸也称3-苯乳酸或β-苯乳酸，是一种安全无毒新型天然广谱生物防腐剂，其分子式为C9H10O3，相对分子质量为166（Alistair L Wilkins，2015）。研究发现，苯乳酸能够抑制多种细菌和真菌的生长，具有较好的溶解性和稳定性，可用作食源性防腐剂。研究发现发酵生产的干酪在成熟过程中产生苯乳酸对食源致病菌具有很强的抑制作用（Dieuleveux V，1998）；同时研究学者进一步确定苯乳酸的广谱抑菌效果（Lavermicocca P，2000）。此外还有研究发现，苯乳酸是丹参的一种衍生物，可应用于医药行业，抑制溶血空斑的形成，增强机体抗氧化能力等（李艳杰，2012）。因此苯乳酸无论是在生物防腐还是医药领域都有非常重要的应用价值。目前合成方法主要有化学合成法和生物合成法。其中化学合成存在许多不足，比如技术条件复杂、反应条件严苛、环境污染比较大等；生物合成苯乳酸是一种新方法，具有环境友好，副产物少的特点（邓林，2014）。研究发现许多微生物发酵都可以产生苯乳酸（李兴峰，2011；Shuhuai，2014）。

单纯依靠菌株自身产苯乳酸，能力有限，通过诱变菌株、改良培养基或是添加底物的方法可以提高苯乳酸的产量。添加底物主要有苯丙氨酸和苯丙酮酸，李兴峰等（2011）研究发现：在乳酸菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的过程中，转氨反应是限速步骤，成为苯乳酸产生的瓶颈，可以采用苯丙酮酸代替苯丙氨酸作为底物合成苯乳酸，因此苯丙酮酸作为底物来提高苯乳酸的产量成为研究热点。但如何同时评价发酵制品中苯乳酸及苯丙酮酸的含量成为研究的难题。因此，开发一种快速分离检测苯乳酸与苯丙酮酸的检测方法是必不可少的。国内外对苯乳酸及苯丙氨酸的分析方法，主要还是薄层层析、气相色谱、液相色谱等，但同时对两种成分进行检测分析的方法在国内外未见报道。本研究通过对液相检测条件的摸索优化，成功开发出一种能够同时检测分析苯乳酸与苯丙酮酸的检测方法，在提高灵敏度及分离度的前提下，减少了分析时间，节省溶剂用量，节约成本。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器设备

三氟乙酸和甲醇（均为色谱级）：天津市永大化学试剂有限公司；MRS肉汤培养基：青岛海博生物技术有限公司；苯丙酮酸标准品（分析纯，纯度≥99.5%）、DL-3苯乳酸标准品（分析纯，纯度≥98%）：美国Sigma公司。

微孔滤膜（直径13 mm、孔径0.22μm），LC-20A液相色谱仪，InertSustain AQ-C18 5μm 4.6×250mm（W）色谱柱，AL204电子分析天平，GL21M高速冷冻离心机，超纯水净化系统（超纯水仪）CLDC271509，雷磁精密酸碱度计PHS-3C，超声波清洗机SB120D。

1.2 试验方法

1.2.1 药品及试剂配制

标准溶液的配制：分别准确称取DL-3苯乳酸标准品0.2058 g（实含苯乳酸0.2048 g）、苯丙酮酸标准品0.2143 g（实含苯丙酮酸0.21 g），用超纯水溶解后定容至100 mL，配制成2.048 g/L的苯乳酸标准溶液和2.100 g/L的苯丙酮酸标准溶液。然后从中分别 吸 取0.625 mL、1.25 mL、2.5mL和5.0 mL用超纯水定容至10.0 mL，各组质量浓度如表1。流动相A（0.05%三氟乙酸水溶液）：0.5 mL三氟乙酸加水定容至1 L；流动相B（0.05%三氟乙酸甲醇溶液）：0.5 mL三氟乙酸加甲醇定容至1 L。

表1 混合标准溶液浓度梯度组成 单位：g/L

1.2.2 色谱条件

HPLC法测定苯乳酸/苯丙酮酸含量，色谱条件为色谱柱：InertSustain AQ-C18 5μm 4.6×250mm（W），柱温箱：30℃，进样量：20μL，流速：1.0 mL/min。流动相A：0.05%三氟乙酸水溶液，流动相B：0.05%三氟乙酸甲醇溶液；梯度洗脱条件：0-15min流动相B的比例由40%升至80%，15-16min流动相B的比例保持80%，16-18min流动相B的比例由80%降至40%，洗脱完成。检测波长210 nm。

1.2.3 样品的制备与提纯

乳酸菌发酵液制备：将超低温冰箱（-80℃）保存的乳酸菌菌株 BLCC2-0011、BLCC2-0021、BLCC2-0024、BLCC2-0026、BLCC2-0038、BLCC2-0069、BLCC2-0323、BLCC2-0327 和BLCC2-0410冻干粉分别接种于MRS固体斜面培养基上，37℃培养24 h；将培养好的菌株，在无菌条件下用接种环挑取一环接种至MRS液体培养基中，37℃静置培养24 h，经10000r/min，离心5min，取发酵上清液经0.22μm滤膜两次过滤后，作为待测样品，采用高效液相色谱法测定苯乳酸/苯丙酮酸含量。

固体样品：使用乳酸菌菌株BLCC2-0021发酵液2%添加，苯丙酮酸0.15%添加，发酵豆粕（料水比100∶45），37℃发酵3天，准确称取5.000 g发酵料样品加入加无水甲醇10 mL，将样品混合均匀后4℃静止4 h，超声提取30 min，混匀后经4000 r/min离心5 min，取上清至20 mL刻度试管，再加无水甲醇10 mL，混匀后经4000 r/min离心5 min，取上清至20 mL刻度试管，定容至20 mL。取定容好的上清液10000 r/min，离心5 min取上清，经0.22μm滤膜两次过滤后作为待测样品，采用高效液相色谱法测定苯乳酸/苯丙酮酸含量。

1.2.4 定性与定量分析

定性分析：利用上述色谱条件分别检测苯乳酸标准品溶液、苯丙酮酸标准品溶液、处理完的样品溶液，确定样品中是否含有苯乳酸或苯丙氨酸。

定量分析：将上述1.2.1中配制的标准溶液利用上述色谱条件分别进样分析，以峰面积和浓度作图，得到苯乳酸或苯丙酮酸标准曲线回归方程，根据峰面积带入公式自动计算样品中各组分的含量。

1.2.5 样品回收率测定

通过在同一发酵液中加入不同浓度标准品混合液，测定该方法的回收率（张建玲，2020）。

1.2.6 样品精密度测定

通过对同一发酵料重复检测5次，测定该方法的精密度。

2 结果与分析

表2 不同菌株发酵24 h苯乳酸、苯丙酮酸产量统计

2.1 色谱分离

按1.2.2所述色谱条件，将苯乳酸标准液、苯丙酮酸标准液和混合标准液分别多次进样分析，确定样品保留时间，苯乳酸标准品的HPLC色谱图（图1，苯乳酸标准品浓度2.048 g/L），可以看出，在10.709 min左右出现苯乳酸色谱峰，且稳定性良好、分离效果好、峰型理想、灵敏度高；苯丙酮酸标准品的HPLC色谱图（图2）可以看出，在10.034 min左右出现苯丙酮酸色谱峰，且稳定性良好、分离效果好、峰型理想；苯乳酸和苯丙酮酸标准品混标的HPLC色谱图（图3）可以看出，在10.034 min左右出现苯丙酮酸色谱峰，在10.709 min左右出现苯乳酸色谱峰，分离效果好，峰型理想。

图1 苯乳酸标准品色谱图

图2 苯丙酮酸标准品色谱图

图3 苯乳酸和苯丙酮酸混标色谱图

国内外有关苯乳酸检测的报道比较多（黄国昌，2016；朱育菁，2015；宁亚维，2021），本实验采用日本岛津公司LC-20A紫外检测器，在激发波长210、254、340 nm分别检测同一样品，发现210 nm条件下检测干扰少、杂峰少，检测效果最佳，最终确定检测波长为210 nm。流动相的优化，流动相A：0.05%三氟乙酸水溶液，流动相B：0.05%三氟乙酸甲醇溶液，少量的三氟乙酸可以与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，起到改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题；梯度洗脱流动相A和B比例的调整，初始流动相B的比例从20%调整到40%时，可以有效避免目标峰的重叠，将苯乳酸与丙苯酮酸分离开。

2.2 标准曲线

以苯乳酸/苯丙氨酸的色谱峰面积（A）对应进样的质量浓度（C，g/L）作图，得到标准曲线如图4、图5。苯乳酸的线性回归方程为C=0.00000002151A-0.1092（R2=0.9955），苯丙酮酸的线性回归方程为

图4 苯乳酸标准曲线

图5 -苯丙酮酸标准曲线

2.3 定性与定量分析

发酵液中苯乳酸及苯丙酮酸的检测如图3所示，目标峰与其他峰分离效果较好，利用该方法可以有效分析发酵液中苯乳酸及苯丙酮酸。根据文献报告多数乳酸菌可以产生苯乳酸，本实验中共检测了10株乳酸菌发酵液中苯乳酸的含量，发现乳酸菌发酵液中苯乳酸的产量在0.1～1.1 g/L不等。这一结果与张雯等之前研究发现酸奶、泡菜等乳酸菌发酵食品中检测出苯乳酸的结果不谋而合，归结起来应该是乳酸菌发酵能够产生苯乳酸（张雯，2020；吴仁蔚，2020）。

关于液体样品的提取，试验中还分别对比了4000 r/min和10000 r/min离心同一样品的色谱图，发现10000 r/min离心过的样品杂峰更少，因此选择液体样品10000 r/min离心的处理方式。关于固体样品苯乳酸检测的前处理方法有很多（邓林，2014），因为苯乳酸微溶于水，提取溶剂一般选择甲醇，比较了甲醇溶解直接检测和甲醇溶解后4℃静止4 h，超声30 min的效果，发现后者苯乳酸提取率相对更高。

2.4 回收率与精密度

上述发酵液加标后，分别统计苯乳酸及苯丙酮酸的含量，计算苯乳酸/苯丙酮酸的加标回收率，统计结果如表3所示。

表3 BLLC2-0021发酵液加标后检测结果统计

将上述发酵料重复5次进样，检测每次发酵料中苯乳酸和苯丙酮酸的含量，检测结果表4所示。结果表明，苯乳酸的回收率、标准偏差分别是100.79%、2.62%；苯丙酮酸的回收率、标准偏差分别是99.12%、0.86%；该方法可靠，重复性好，符合国家标准。

表4 BLLC2-0021发酵料重复进样结果统计

3 结论

本研究通过使用甲醇提取发酵制品中苯乳酸及苯丙酮酸，建立了一种同时检测发酵液及发酵制品中苯乳酸和苯丙酮酸的检测方法，与传统检测方法相比，该方法更加简单、准确、且分离效果比较好，10.709 min左右出现苯乳酸色谱峰，10.034 min左右出现苯丙酮酸色谱峰。本研究建立起来的方法可以满足发酵工艺中防腐物质苯乳酸的检测，以及工艺升级苯丙酮酸残余量的检测。

参考文献：（略）