不同菌株组成饮用型酸奶发酵剂指纹图谱的构建

2021-10-22 00:22杨菲菲麻志宁王祎李红娟李洪波于景华王妙姝康红艳
食品与发酵工业 2021年19期
关键词:发酵剂挥发性饮用

杨菲菲,麻志宁,王祎,李红娟,李洪波,于景华*,王妙姝,康红艳

1(天津科技大学 食品科学与工程学院,天津,300457) 2(北京三元食品股份有限公司,北京,101107) 3(河北新希望天香乳业有限公司,河北 保定,071000)

饮用型酸奶主要以鲜牛乳为原料,杀菌后接种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌,凝固成型后破乳均质而制成[1]。酸奶独特的香气是人们鉴别它的重要方式[2]。酸奶中的挥发性物质的数量和种类决定了酸奶的风味品质[3]。其中大约有100多种挥发性物质被鉴定出来,包括酮类、醛类、酯类、酸类和其他[4]。这些物质由乳脂的分解以及乳糖、柠檬酸盐的微生物转化产生[5],形成了酸奶独特的味觉体验。

不同菌种发酵成的酸奶挥发性风味物质不同。典型饮用型酸奶风味形成的基本挥发性成分是乙醛、丙酮、2-丁酮、乙二酰、乙酸乙酯和乙醇[6]。王琴等[7]报道,复配菌株的生成风味物质的种类和含量普遍高于单菌株的平均水平。嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的的互利共生作用已被广泛认可。科汉森、丹尼斯克、多爱特品牌推出球菌占绝对优势的直投式发酵剂在中国市场得到广泛应用。

顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术(headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME/GC-MS)被广泛用于挥发性化合物的测定,能有效对食物样品中挥发性化合物进行分析鉴定[8]。食品指纹图谱利用食品的特有品质达到区分鉴别的目的,这个过程中包含特定的数值转换处理。香气指纹图谱主要采用对样品中的各种风味化合物提取,分析其组成和含量,从而建立该产品的共有模式体系[9]。

目前,国内外学者对酸奶的挥发性风味物质研究集中在不同地域酸奶的风味物质比较[10],或者是一种菌的不同菌株产生的风味物质[11],也包括在发酵的不同阶段所产生的风味物质[12]。但是,很少有研究通过酸奶的挥发性风味物质建立饮用型酸奶的香气指纹图谱。本研究探究了10种商业发酵剂饮用型酸奶的挥发性风味成分,对发酵剂菌种为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的饮用型酸奶进行HS-SPME/GC-MS分析,构建饮用型酸奶的指纹图谱。采用主成分分析分析10种饮用型酸奶的14种特征性风味物质,为酸奶的品质评价及质量控制提供参考标准。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛乳,沧州市牛奶厂;白砂糖,河北古松农副产品有限公司;果胶,内蒙古阜丰生物科技有限公司;稀奶油,山东君君乳酪有限公司;乳清蛋白粉(WPC8200),天津银河伟业进出口有限公司;10种发酵剂:科汉森903、科汉森904、科汉森Mild1.0,科汉森有限公司(以下简称品牌一);丹尼斯克863、505、883,丹尼斯克有限公司(以下简称品牌二);多爱特JOINTEC D、多爱特VH349、多爱特JOINTEC Y14、多爱特 JOINTEC VB539,北京多爱特生物科技有限公司(以下简称品牌三),依次编号为A1~A10。

1.2 仪器和设备

GCMS-QP2010型岛津气相色谱-质谱联用仪,日本Shimadzu 公司;57348-U型手动 SPME 进样器、DVB/CAR/PDMS萃取头(50/30 μm),带有硅胶垫帽的萃取瓶(15 mL),美国Supelco公司;DB-WAX型毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司;JR-2型集热式磁力加热搅拌器,天津市欧诺仪器仪表有限公司;YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸气灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;TW-Basic高压均质机,上海沃迪公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的制备

商业发酵剂制备饮用型酸奶样品的流程:

原料乳→添加配料→共同升温至(50±2) ℃→定容均质→杀菌(95 ℃、5 min)→冷却(41~42 ℃)→接种→发酵5.5~7.5 h →冷却(9~13 ℃)→搅拌、均质→灌装→后熟(4 ℃、12 h)→冷藏

实验前将要用到的玻璃仪器在121 ℃、15 min下高压蒸气灭菌。配料过程包括:先称取白砂糖与果胶、琼脂、拌匀,用少量温水进行溶解,然后水合30 min,再将剩余白砂糖、乳清浓缩蛋白粉、稀奶油、混匀,用热水溶解水合30 min。水合结束后,将2种配料混合再加入原料乳定容。

1.3.2 挥发性风味物质测定分析

HS-SPME条件:将萃取头在气相色谱260 ℃老化30 min,用50/30 μm CAR/DVB/PDMS萃取头对挥发性和半挥发性成分进行萃取。酸奶5 g放于15 mL顶空进样瓶,加入NaCl封盖。放到磁力恒温搅拌器中。吸附温度选择45 ℃。萃取时间选择45 min。选择磁力搅拌的方式进行样品搅动,搅拌使用磁力搅拌器进行样品搅拌。转速选择800 r/min,每5 g酸奶加入1.2 g NaCl。

GC条件:采用程序升温方式,起始温度为40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min升温到180 ℃,保持1 min,7 ℃/min升温到250 ℃,保持5 min;进样口温度:250 ℃,传输线230 ℃;载气为He,流速2.0 mL/min;不分流进样。

MS条件:离子源温度为220 ℃,接口温度220 ℃。电离方式为EI,电子能量70 eV;扫描范围30.00~500.00 u。发射电流100 μA,检测电压1.4 kV。

定性和定量分析:利用随机携带Masshunter 工作站NIST 11标准库进行搜索,查找有关质谱资料,分别对各峰所代表的风味化合物的化学结构和名称加以确认。利用面积归一化法计算各组分峰面积百分比(相对含量)。

1.4 指纹图谱相似度计算

采用夹角余弦法和相关系数法分析发酵乳样品气味指纹图谱间的相似性,该算法能够反映和识别复杂风味成分在化学组成与含量比例上的相似性。夹角按公式(1)[13]计算:

(1)

式中:Xik,第i个样品的第k个特征变量;Xrk,特征指纹图谱的第k个特征变量。

相关系数相似度如公式(2)所示:

(2)

1.5 统计分析

采用Origin 9.0软件建立GC-MS指纹图谱及进行主成分分析。数据处理和显著性分析使用SPSS 23.0,实验结果用平均值±标准差表示,采用单因素方差分析分析组间差异,以P<0.05表示差异显著。所有实验重复测定3次。

2 结果与分析

2.1 GC-MS结果分析

10种酸奶样品HS-SPME/GC-MS检测结果如表1所示。10种饮用型酸奶的风味成分种类无明显差别,能保证酸奶的整体风味,但各类物质的含量及呈味阈值差距很大,使得10种酸奶呈现不同的风味特征。

10种酸奶中共检测出61种挥发性风味物质,包括醛类9种、酮类11种、酸类7种、酯类11种、醇类15种、芳香族及烷烃化合物8种。酮类物质是酸奶风味物质中占比较多的化合物,对酸奶风味的贡献具有重要作用[14]。A1~A10酸奶样品中的酮类物质大部分由双乙酰、2-庚酮、3-羟基-2-丁酮、2-壬酮组成。双乙酰呈现甜香、奶油味[15],2-庚酮呈现腐臭、奶酪味[15],3-羟基-2-丁酮呈现黄油味[15],2-壬酮带有奶油、果香味[16]。实验测得3-羟基-2-丁酮含量是所有风味物质中最高的,与前人的研究[17]相符。虽然其含量高,但是对酸奶风味的影响却不如双乙酰[18]。醛类的风味阈值一般很低,对整体风味贡献大,是各种氧化风味的来源[19]。乙醛、壬醛和癸醛对酸奶样品的风味物质贡献较大,乙醛呈现芳香味[14],壬醛呈现蜡香、脂肪香[16]。醇类化合物虽然种数较多,但其风味阈值高,对酸奶的风味贡献度不大[20]。醇类物质中2-乙基己醇和正辛醇含量相对较高,2-乙基已醇具有甜味和花香[16]。挥发性酸类物质是由乳酸菌在代谢过程中产生,酸味物质中含量较高的是乙酸、丁酸、己酸、辛酸,乙酸带有辛辣的酸味[15],丁酸呈现腐臭的、汗臭的[15],己酸则是辛辣的、有花香的[16]。辛酸在10种酸奶中的含量无显著性差异。酯类化合物在酸奶中的风味感知较高,对酸奶风味形成的作用也很大[21]。酯类物质中己二酸二辛酯占优势,己二酸二辛酯带有水果香气和甜味[14]。

酸奶的风味协调性与双乙酰和乙醛的比例有较大关系。华朝丽等[22]认为,当双乙酰:乙醛在3.0~4.5时,酸奶呈现协调的芳香味。A1~A10的双乙酰:乙醛在0.90~4.37,而A5酸奶是唯一一组双乙酰:乙醛<1的酸奶样品,可能与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在整体发酵剂的占比有关。乙醛和双乙酰一直被认为是酸奶中的重要风味成分[23]。尽管目前的分析设备能够检测出许多挥发性化合物,但只有少数挥发性化合物的浓度足够高,足以对酸奶的感官特性起到至关重要的作用[1]。乙醛更多地被认为由保加利亚乳杆菌发酵产生,而双乙酰由嗜热链球菌发酵产生[24]。10种商业发酵剂的菌种组成不同,例如多爱特品牌JOINTEC D由95%的嗜热链球菌和5%的保加利亚乳杆菌组成,产酸速度适中,酸奶在货架期内具有温和的风味。

2.2 指纹图谱的建立

2.2.1 参考峰的确定

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统建立指纹图谱,构建饮用型酸奶指纹图谱[25]。由于发酵乳是一个类似中药的复杂体系,所以应用指纹图谱技术可以全面反映发酵乳中风味化合物的种类和数量,评价发酵乳的品质。选择1个保留时间在15.7 min左右的色谱峰,且该峰位于色谱图中靠近中心的位置,峰的强度较高,分离度较好,同时是10种样品共同拥有的物质,将此峰作为参考峰。经过GC-MS分析可知,此峰为乙酸。乙酸的相对保留时间和相对峰面积分别为1和100。

2.2.2 特征风味指纹图谱的构建

选定参考峰后计算所有色谱图中其他挥发性风味物质的相对峰面积和相对保留时间,最后选择相对峰面积Sr>1%的共有峰[26],以各共有峰的集合作为样品的特征指纹峰。将所得的共有峰相对峰面积进行平均,得出标准图谱,作为特征指纹图谱。

10种不同发酵剂酸奶绘制的重叠色谱图如图1所示,饮用型酸奶特征风味指纹图谱信息如表2所示。10种不同商业发酵剂所制酸奶中挥发性化合物相对峰面积>1%的共有峰有14种,可将其视为酸奶的特征风味物质。14种特征风味物质中包括3种醛、4种酮、4种酸、2种醇及1种酯类。即乙醛、双乙酰、2-庚酮、3-羟基-2-丁酮、2-壬酮、壬醛、乙酸、2-乙基己醇、癸醛、正辛醇、丁酸、己酸、辛酸、己二酸二辛酯。

图1 10种商业发酵剂酸奶特征风味指纹图谱Fig.1 Characteristic flavor fingerprints of yogurt fermented by 10 commercial starter cultures

表2 饮用型酸奶特征风味指纹图谱信息Table 2 The information on characteristic flavour fingerprints of drinking yogurt

2.3 发酵乳中风味物质的主成分分析

取10种酸奶样品进行主成分分析,样品点与14种特征风味物质在主成分载荷图上越接近,两者的相关性越高。14种特征风味物质的主成分载荷图如图2所示。

图2 14种特征风味物质的主成分载荷图Fig.2 Principal component loading diagrams of 14 characteristic flavor substances

从图2可知,A1、A2、A3和A4酸奶的发酵风味与2-庚酮、壬醛、2-乙基已醇等风味物质有较强的相关性,A5酸奶的发酵风味与2-壬酮、乙醛、乙酸、癸醛有较强的相关性,A6、A7、A8、A9、A10酸奶的发酵风味与丁酸、己酸、己二酸二辛酯具有较强的相关性。先前的研究认为癸醛对整体风味有重要修饰作用而不是关键性作用,这主要是因为关键性风味物质在发酵及贮藏各阶段呈不断变化状态,使发酵乳呈现出不同的风味特征[27]。主成分得分图的4个象限将品牌一和品牌三也有很好的区分,而品牌二3个样品在图2中分布零散,说明品牌一和品牌三所选样品具有更高的整体性。

2.4 酸奶指纹图谱构建方法的验证

在指纹图谱的构建过程中,为保证特征香气指纹信息的准确度,需要对指纹图谱的构建方法在精密度、重复性和样品稳定性方面进行考察。14种特征性风味物质的峰面积占总鉴定峰面积的90.18%。

根据1.3.1所述方法,用发酵剂科汉森903制作5份酸奶样品,进行精密度实验(重复进样5次)、重复性试验(平行样品5份)以及稳定性试验(样品在分别放置0、2、4、8、12和24 h后取样测定,共6组),记录主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积,结果见表3。酸奶特征香气指纹峰的相对保留时间值的标准偏差均小于0.3%,相对峰面积的标准偏差均小于3.0%,说明所建立的方法用于酸奶特征香气指纹图谱的分析具有良好的精密度、重复性和稳定性。

表3 指纹图谱构建方法的精密度、重复性和稳定性研究Table 3 Precision,repeatability and stability of fingerprint construction methods

2.5 指纹图谱的相似度评价

色谱指纹图谱的相似度是计算原始数据的相关系数和夹角余弦值来评价指纹图谱的必要条件[28]。利用相似性评价软件、中国药典委员会推荐的模式识别程序和本实验室开发的互补软件,对色谱图进行统计评价[29]。10种商业发酵剂酸奶相似度分析如表4和图3所示。

表4 10种商业发酵剂酸奶相似度分析Table 4 Similarity analysis of yogurt fermented by 10 commercial starter culture

图3 10种商业发酵剂酸奶特征风味指纹图谱相似度评价Fig.3 Similarity evaluation of flavor fingerprints of yogurt fermented by 10 commercial starter cultures

如图3所示,对10个饮用型酸奶样品的GC-MS色谱图进行分析,利用14个特征峰的相对峰面积进行相似度计算,用于建立普通饮用型酸奶特征风味指纹图谱的10个酸奶样品通过向量夹角余弦法所得值和相关系数法所得值如表4所示。一般认为相似度>0.90时,构建特征风味指纹图谱的酸奶样品与标准指纹图谱拥有较好的一致性[30]。这两种方法得到的相关度最低值为0.925 5,说明普通饮用型酸奶样品的风味指纹图谱基本一致。10种商业发酵剂酸奶在后熟完成时产生的风味物质在整体宏观上具有较高的相似性。

3 结论

利用固相微萃取与气质联用技术以及主成分分析的方法分析了10种商业发酵剂饮用型酸奶的风味物质。以乙酸作为参考物质,选择相对峰面积>1%的14种特征风味物质,建立了能够反映酸奶特征风味的指纹图谱。10种酸奶中共检测出61种挥发性风味物质,包括醛类9种、酮类11种、酸类7种、酯类11种、醇类15种、芳香族及烷烃化合物8种。通过对构建饮用型酸奶特征香气指纹图谱的方法进行验证,表明该构建方法具有良好的精密度、重复性和稳定性。通过相似度分析,证明了所选定的10个酸奶样品构建的指纹信息准确可靠。利用所构建指纹图谱信息能对不同菌种酸奶特征香气进行有效区分。

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