人和非洲象AXIN1基因的鉴定与生物信息学分析

于芳芳,柴思敏,谷 龙,郑 煜,周 旭,徐士霞,任文华

(南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210023)

睾丸是雄性哺乳动物生殖系统的核心器官,其发育常需伴随自身的下降,这个下降过程是指睾丸从尿生殖嵴经腹腔降至阴囊. 睾丸的下降过程分为两个阶段,分别是腹腔内迁移阶段和腹股沟阴囊阶段. 临床上把睾丸未下降到阴囊的现象称为隐睾. 通常人在出生时就已经完全下降到阴囊内,鼠类在出生后3周左右完成这一过程[1-4]. 然而,生理解剖学家们发现并不是所有的哺乳动物的睾丸都会下降到阴囊,如金毛鼹、象等动物的睾丸未下降,仍然保留在腹腔中;人、黑猩猩等灵长类动物的睾丸则下降至体腔外的阴囊中[5]. 隐睾的发生较为复杂,涉及遗传、解剖、神经内分泌及环境等因素的相互作用[3].

AXIN1(axis formation inhibitor)是体轴发育抑制因子,在胚胎发育过程中控制着体轴的形成,以前被鉴定为小鼠Fused基因座的产物,定位于人染色体16p13.3,与小鼠蛋白具有87%的相似性. 目前已经证实了AXIN1基因在线虫、果蝇、斑马鱼、爪蟾、鸡、小鼠、大鼠、人中都非常保守;普遍表达于不同的组织,包括脑、胸腺、心脏、肺、肝、脾和肾等[6].AXIN1的突变会导致神经外胚层缺陷(不完全闭合、头部皱褶的畸形或截断)、心脏缺陷、胚轴重复和纯合子的早期胚胎致死[7]. AXIN1的功能也与许多疾病和肿瘤的发生和发展有关. 此外,AXIN1与几种不同的蛋白质复合物结合,参与了Wnt、转化生长因子(TGF-β)、应激激活蛋白激酶JNK1(JNK)和细胞肿瘤抗原p53信号通路[8-9]. 经典Wnt信号通路不仅调节脊椎动物和无脊椎动物的细胞增殖、分化、形态和运动,它的激活也是某些隐睾症的潜在病因[10]. AXIN1作为Wnt信号通路中破坏复合物的中心支架,它直接与Wnt/β-catenin信号传导中的许多组分相互作用,如LRP、DVL、PP2A、APC、CK1、GSK3β和β-catenin,可能在隐睾症的发展中起重要作用. 对113名隐睾患者与179名健康的志愿者进行SNP分析,研究发现隐睾症患者和对照组之间AXIN1标签SNP的等位基因和基因型频率存在显著差异,这意味着这些等位基因和基因型可能是导致隐睾症发生的因素[11].

通过对基因座的分析发现,人AXIN1具有两种亚型,a亚型由11个外显子组成,基因转录产物全长为3 675 bp,翻译蛋白含862个氨基酸残基;b亚型在3′编码区缺少框内第9个外显子,序列长度为3 567 bp,翻译826个氨基酸[12]. 经过实验室的前期序列分析发现(待发表数据),对睾丸完全未下降物种(金毛鼹、非洲象、鸭嘴兽等)和睾丸完全下降物种(人、黑猩猩、小鼠等)的AXIN1基因进行序列比对,在睾丸完全未下降的物种中AXIN1基因的第9个外显子缺失. 本文分别选取睾丸完全未下降和睾丸完全下降中的代表物种非洲象和人进行生物信息学分析. 非洲象的AXIN1基因由10个外显子组成,基因转录产物全长为 2 733 bp,由833个氨基酸组成. 与人的AXIN1a亚型基因序列比对发现,非洲象缺失的部分为第9个外显子,共108 bp,和人的b亚型相似. 因此本研究通过实验鉴定非洲象的AXIN1基因序列是否存在缺失,并通过生物信息学方法对人和非洲象的AXIN1基因进行分析,为进一步研究AXIN1基因与睾丸位置的相关性提供基本材料和理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

非洲象的肌肉样本(来自死亡个体)为本实验室保存. 组织裂解液(10 mmol/L Tris-cl,500 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,PH=7.5～8.0);蛋白酶k、Tris-饱和酚、苯酚、氯仿异戊醇(体积比24∶1)、醋酸钠购自上海生工生物有限公司;普通Taq DNA polymerase购自TaKaRa;无水乙醇为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 基因鉴定

用酚氯仿抽提法提取非洲象基因组DNA. 取非洲象肌肉组织于1.5 mL Eppendorf管中,加入组织裂解液600 μL,蛋白酶K(20 mg/mL)10 μL,充分混匀,55 ℃消化过夜;去除已经消化好的样品,以5 000 rpm的速度于4 ℃离心10 min,除去杂质,取上清液至新的1.5 mL Ep管中;加入等体积Tris-饱和酚,将离心管置于旋转皿上旋转10 min～15 min,温和混匀两相,使管内内容物混成乳浊物;以 8 000 rpm的速度于4 ℃离心15 min,取上清液至新的1.5 mL Ep管中;加入等体积氯仿异戊醇,颠倒混匀10 min～15 min,再次以 8 000 rpm的速度于4 ℃离心15 min;将上层水相转移至新的1.5 mL Ep管中,加入0.1倍体积醋酸钠混匀,再加入2.5倍体积冷的无水乙醇,上下颠倒Ep管至溶液彻底混匀;-20 ℃冰箱沉淀DNA至少3 h(可过夜);取出后以12 000 rpm的速度于4 ℃离心10 min,去除上清液,留沉淀;向Ep管中加入1 mL 75%乙醇,以12 000 rpm的速度于4 ℃离心10 min;倒掉乙醇,向Ep管中加入1 mL 75%乙醇,再次离心,条件同上,做第二次洗脱;再次调转Ep管在离心机里的方向,以12 000 rpm的速度于4 ℃离心10 min,用200 μL的枪小心吸走乙醇,然后开盖晾干乙醇;加入50 μL双蒸水沉解,4 ℃保存.

通过NCBI在线网页(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在外显子序列上设计引物,引物由上海生工生物有限公司合成,引物序列如下:

Loxodonta Africana F:5′AAGAGGAGAAGCGAACCAGC3′,

Loxodonta Africana R:5′CCCGCCTTCTTCTGTGACTT 3′.

PCR体系:基因组DNA模板2 μL,正反向引物各1 μL,dNTP Mixture 15 μL,用双蒸水补足至25 μL. PCR反应程序为:95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,35个循环. 反应结束后对扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测,然后由上海生工测序.

1.2.2 基因序列数据来源

本文所用数据均来源于NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),从中获取人和非洲象AXIN1基因的基因序列以及对应的氨基酸序列进行数据分析.

1.2.3 生物信息学分析

运用以下在线网站分别预测AXIN1基因和AXIN1蛋白性质:Neural Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测基因潜在核心启动子;NCBI数据库中的ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对基因进行开放阅读框的分析;Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的分子量、分子式、等电点、脂肪系数、不稳定系数、半衰期、平均亲水系数,以及氨基酸组成;ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)进行蛋白质疏水性分析;SingalP5.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析信号肽;TMHMM Sever.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白质的切割位点及跨膜区域;NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)预测磷酸化位点;PSORT II Prediction(https://psort.hgc.jp/form2.html)分析蛋白的定位信息;SOPMA(https://npsa-pbil.ibcp.fr)分析蛋白质的二级结构;I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)预测蛋白质的三维结构;Pymol软件对人和非洲象两种蛋白质的三维结构叠合比对;MEGA软件对人和非洲象的AXIN1蛋白质序列进行比对;STRING(http://string-db.org)推测有可能与人和非洲象AXIN1有直接或间接相互作用的蛋白质;NCBI的CDD(Conserved Domain Database)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测蛋白质的保守结构域.

2 结果与讨论

2.1 非洲象AXIN1基因缺失的实验验证

首先利用NCBI数据库下载人和非洲象的AXIN1序列,分别选取最长的转录本,利用MEGA软件比对. 与人相比,非洲象的AXIN1基因缺失第9个外显子(108 bp)(图1A). 通过构建基因组本地数据库,以近亲缘物种的基因序列作为“query”筛选基因组中非洲象的序列,将非洲象的每个外显子前后延伸200 bp,最后确保能够完整获得第8和第10个外显子之间的内含子序列. 根据NCBI数据库网站中的非洲象AXIN1序列设计引物,分别在第8个和第10个外显子上设计上下游引物,以提取的非洲象全基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到约200 bp的条带(图1B). 将测序结果与本地blast的结果进行比对,发现测序结果与下载的结果一致,即第8个和第10个外显子之间全部为内含子序列,没有第9个外显子的序列.

图1 非洲象AXIN1基因缺失部分验证Fig.1 Verification of the missing part of the Loxodonta africana AXIN1 gene

2.2 人和非洲象AXIN1基因的生物信息学分析

2.2.1 人和非洲象AXIN1基因的核心启动子分析

本研究分别选取人和非洲象AXIN1基因的最长转录本进行分析,研究结果(表1)表明人AXIN1基因共有两种核心启动子,分为143 bp～193 bp、492 bp～542 bp,并且这两种核心启动子的得分值均为0.8及以上,因此推测这两处是人AXIN1基因核心启动子.

表1 人和非洲象AXIN1基因的核心启动子Table 1 Core promoter of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 gene

非洲象AXIN1并没有预测到核心启动子.

2.2.2 人和非洲象AXIN1基因的开放阅读框分析

本次研究的分析结果(图2)表明,人和非洲象都在ORF1阅读框有最长的开放阅读框架. 人AXIN1基因的开放阅读框架长度为2 589 bp,编码862个氨基酸;非洲象AXIN1基因的开放阅读框架长度为2 502 bp,编码833个氨基酸.

图2 人和非洲象AXIN1基因序列的ORF分析Fig.2 ORF analysis of AXIN1 gene sequence of Homo sapiens and Loxodonta africana

2.2.3 人和非洲象AXIN1蛋白质的理化性质分析

ProtParam 分析结果(表2)表明,人AXIN1蛋白质的相对分子量为959 340.97,分子式为C4158H6544N1240O1300S29,消光系数是80 760;等电点(pI)是6.50,该蛋白为酸性蛋白;带负电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为125个,带正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为117个;不稳定系数是54.62,该蛋白为不稳定蛋白;在网织红细胞中该蛋白的半衰期是30 h;脂肪系数为62.94;总平均亲水系数为-0.794;该蛋白是亲水性蛋白(负值为亲水性蛋白,正值为疏水性蛋白).

表2 人和非洲象AXIN1蛋白质的理化性质分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 protein

非洲象AXIN1蛋白质的相对分子量92 414.41,分子式是C4030H6349N1183O1265S25,消光系数为79 020;理论等电点为6.48,该蛋白为酸性蛋白;带负电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为118个,带正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为110个;其不稳定系数为55.89,该蛋白为不稳定蛋白质;在哺乳动物网织红细胞内该蛋白的半衰期为30 h;脂肪系数为63.84;总平均亲水系数为-0.770,该蛋白是亲水性蛋白.

用ProtScale 在线工具进行疏水性分析,同样可得出这两个蛋白为亲水性蛋白.

2.2.4 人和非洲象AXIN1蛋白质的信号肽、跨膜区域预测

信号肽(SP)是许多新合成蛋白质的氨基末端的短氨基酸序列,能将蛋白质靶向到膜中或跨膜[13]. 利用Singal P5.0 sever在线分析工具对人和非洲象的AXIN1信号肽进行预测,结果发现,两种蛋白质均不含信号肽. 利用TMHMM Sever.2.0分析人和非洲象的AXIN1蛋白质发现也不存在跨膜区域.

2.2.5 人和非洲象AXIN1蛋白质的磷酸化位点预测

磷酸化修饰是一种重要且常见的蛋白质翻译后修饰方式,蛋白质的可逆磷酸化与去磷酸化过程是真核细胞生命活动中最普遍的调控手段,广泛参与到细胞周期、分化和发育、代谢和神经活动、肌肉收缩和转录调节等生命过程中[14]. 利用NetPhos 3.1 Server在线网页对蛋白质进行分析发现,人AXIN1蛋白质的磷酸化位点中置信度达到90%以上的位点共有39个,非洲象AXIN1蛋白质的磷酸化位点共有33个(图3).

横坐标为序列位置,纵坐标为磷酸化的可能性. 阈值为 0.5(红横线)图3 人和非洲象AXIN1的磷酸化位点预测Fig.3 Phosphorylation site prediction of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1

2.2.6 人和非洲象AXIN1蛋白质的亚定位分析

通过在线网页PSORT II Prediction预测蛋白质的定位信息,发现人和非洲象AXIN1蛋白质位于相同的细胞结构中,分别为细胞质、线粒体和细胞核. 其中人的AXIN1蛋白质存在于细胞质、线粒体和细胞核的概率分别为73.9%、17.4%、8.7%;非洲象的AXIN1蛋白质存在于细胞质、线粒体和细胞核的概率为69.6%、17.4%、13.0%(表3).

表3 人和非洲象AXIN1蛋白质的亚定位预测Table 3 Prediction of sublocalization of AXIN1 protein in Homo sapiens and Loxodonta africana

2.2.7 人和非洲象AXIN1蛋白质序列比对

通过MEGA软件对人和非洲象AXIN1的氨基酸序列比对发现(图4),除了在第9个外显子有插入缺失之外,在第1位、第57位、第513位、第617位、第675～679位也存在插入缺失,此外两者的氨基酸位点存在多处不同.

“*”表示人和非洲象AXIN1的氨基酸位点相同,“.”表示人和非洲象AXIN1的氨基酸位点不同,“-”表示在人或者非洲象的AXIN1中存在缺失,红框表示人和非洲象中插入缺失的序列图4 人和非洲象AXIN1蛋白序列比对结果Fig.4 Alignment results of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 protein sequence

2.2.8 人和非洲象AXIN1蛋白质的二级结构分析

利用在线分析软件SOPMA预测分析人和非洲象AXIN1蛋白质所形成的二级结构. 将蛋白质序列提交至SOPMA,构象状态选择3,包括α螺旋(Hh)、β折叠片(Ee)和无规则卷曲(Cc),所得结果如图所示(图5). 人AXIN1蛋白中分别有233个α螺旋(27.03%),47个β折叠片(5.45%)和582个无规则卷曲(67.52%);非洲象AXIN1蛋白中分别有230个α螺旋(27.61%),50个β折叠片(6.00%)和553个无规则卷曲(66.39%). 人和非洲象AXIN1二级结构的α螺旋、β折叠片和无规则卷曲数量没有显著差别,但是它们的α螺旋、β折叠片和无规则卷曲位置存在差别.

图中带有颜色的小写英文字母表示二级结构,橙色的 c 代表无规则卷曲,红色的 e 代表β折叠片,蓝色的 h 代表 α螺旋图5 人和非洲象AXIN1蛋白质的二级结构预测Fig.5 Prediction of the secondary structure of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 protein

2.2.9 人和非洲象AXIN1蛋白质的三维结构预测

通过在线网站I-TASSER对人和非洲象AXIN1的氨基酸序列进行同源三维建模(图6),两种蛋白质都由一条链构成,红色代表蛋白质的N端,深蓝色代表蛋白质的C端. 用Pymol软件对两种蛋白质的三维结构进行比对,能够获得两者相互重叠的一系列三维坐标. 二者重叠的结构能够用来计算RMSD(root mean square deviation)值,RMSD值衡量的是两个结构之间的区别程度. RMSD越小,相似度越高. 研究分析表明,RMSD=30.713,说明两者的蛋白结构差异较大.

图6 人和非洲象AXIN1蛋白三维结构预测Fig.6 Prediction of the three-dimensional structure of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 protein

2.2.10 人和非洲象AXIN1蛋白质互作关系预测

本研究通过STRING在线网站推测可能与人和非洲象AXIN1有直接或间接相互作用的蛋白质. 利用此网站获得蛋白互作网络图(图7),并将相互作用的的蛋白质信息绘制成表格(表4、5). 与人AXIN1有相互作用的蛋白质是GSK3β、APC、CTNNB1、SIAH1、LRP5、LRP6、DVL1、GSK3A、TNKS、AMER1;与非洲象AXIN1有相互作用的蛋白质是GSK3β、APC、CTNNB1、DVL1、GSK3A、CSNK1A1、CSNK1E、DVL2、LRP5、SIAH1.

A和B中线条的粗细代表相互作用关系的强弱,圆圈代表相互作用的蛋白质图7 人和非洲象AXIN1与其他蛋白质的互作关系预测Fig.7 Prediction of the interaction between Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 and other proteins

表4 人AXIN1与其他蛋白质的互作关系信息表Table 4 Information table of interaction between Homo sapiens AXIN1 and other proteins

2.2.11 人和非洲象AXIN1蛋白质的保守结构域预测

本研究通过NCBI的CCD数据库推测人和非洲象AXIN1蛋白质的保守结构域,发现人和非洲象的AXIN1蛋白质中都具有4个保守结构域,分别是RGS_Axin、DIX、Axin_TNKS_binding、Axin_b-cat_bind super family(图8).

图8 人和非洲象AXIN1蛋白质的保守结构域预测Fig.8 Prediction of the conserved domains of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 protein

3 结论

精子发生和精子储存的温度需要低于37 ℃,睾丸作为精子发生的重要场所,需要保持低温环境[15]. 睾丸下降至阴囊的胎盘哺乳动物,通过睾丸自身的调节可以使睾丸保持低温状态;而对于海豹、海牛、鲸类等睾丸下降而无阴囊的物种来说,可能不需要睾丸下降到体外实现降温,如鲸类和海豹已经进化出独特血管结构来冷却睾丸,鲸类用冷的浅表静脉血降低睾丸动脉血的温度,海豹中存在血管逆流换热系统实现睾丸冷却[16]. 而对于非洲象等睾丸未下降的物种来说,他们的体温与许多阴囊型哺乳动物相似,体内也没有类似的冷却系统. Sharma等的进化研究结果表明睾丸下降是胎盘哺乳动物的祖先状态,随后在非洲兽总目的进化过程中转变为未下降睾丸,但是关于非洲象等物种睾丸未下降的原因需要解剖学和实验进一步研究[15].

AXIN1是一种重要的抑癌基因,其蛋白含有多个重要的功能结构域,可以与多种蛋白质相互作用来行使生物学功能,参与多种信号通路的传导[8]. 人AXIN1具有两种亚型,a亚型由11个外显子组成,b亚型由10个外显子组成,b亚型中缺失的第9个外显子能够与Wnt信号通路中的PP2A蛋白质结合[12]. PP2A是四种主要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶之一,是一种异源三聚体酶,其核心二聚体是由36 kDa催化亚基C和65 kDa调节亚基A组成,B亚基的大小范围为24 kDa～130 kDa. PP2A广泛表达并在细胞周期调控、细胞转化、细胞分裂等过程中起作用[17]. Hsu等[17]推测缺乏PP2A结合结构域的AXIN1蛋白可以刺激GSK-3β/β-catenin相互作用而不会被PP2A调节,会使下游的β-catenin继续被磷酸化,进而导致β-catenin在细胞质中被降解. Kaftanovskaya等[18]的研究表明肌源性转录物的产生依赖于β-catenin到达细胞核与TCF/LEF结合形成复合物,β-catenin的条件性敲除会导致提睾肌无法形成,进而导致腹腔内隐睾. 最近的研究结果也表明,INSL3信号通过Notch和Wnt/β-catenin通路刺激引带细胞发育[18]. 本研究依托实验室前期研究结果,对人和非洲象的AXIN1基因进行鉴定发现,与人AXIN1基因的a亚型相比,非洲象的基因缺失第9个外显子,与人的b亚型相似. 非洲象AXIN1基因第9个外显子的缺失可能导致其蛋白结构缺失与蛋白PP2A结合的结构域,导致Wnt信号通路中的β-catenin在细胞质中被降解,提睾肌无法形成;同时INSL3的信号无法传导,引带细胞的发育受到限制,进而导致隐睾症的发生. 因此认为非洲象AXIN1第9个外显子的缺失可能是导致非洲象睾丸未下降的因素.

对于核心启动子的预测分析发现,人有两种核心启动子,说明人有两种转录本,这与文献中结果相符合. 对于非洲象的核心启动子预测并没有发现核心启动子,关于其原因需要实验进一步研究. AXIN1能够与多种蛋白质相互作用,但是人和非洲象的相互作用蛋白存在差别. LRP5和LRP6是低密度脂蛋白家族的成员,在Wnt信号通路中,作为一种跨膜受体,能够与Wnt分泌性糖蛋白结合,从而启动信号通路[19]. AMER1(APC membrane recruitment 1)是在脊椎动物中保守的1135个氨基酸的质膜相关蛋白,通过充当β-catenin破坏复合体的支架蛋白并促进质膜上AXIN1的稳定,在Wnt信号传导中发挥其负调控作用[20]. CSNK1A1基因编码酪蛋白激酶1α(CK1α),是Wnt信号通路的关键调节因子,它的缺失诱导Wnt信号和p53信号激活[21]. CSNK1E编码的酪蛋白激酶1ε是丝氨酸/苏氨酸选择性激酶家族的成员,该激酶具有多种分子底物和生物学功能,包括对Wnt信号通路的调控以及在调控昼夜节律等方面发挥作用[22]. 细胞质DVL蛋白家族通过AXIN1和GSK3β的连接,充当Wnt信号通路的正调节剂,调节细胞增殖、极性和细胞命运. 目前研究表明DVL1和DVL2与乳腺癌、前列腺癌等癌症相关[23]. TNKS是包含18个成员的聚合酶(PARP)蛋白质超家族,具有通过减少AXIN1升高WNT的表达来增加β-catenin的能力[24]. 与人相比较发现,非洲象的AXIN1蛋白能够与CK1α结合抑制Wnt信号的启动,可能会导致 β-catenin 在细胞质中被泛素化而降解,从而无法启动细胞核中WNT靶基因的转录激活. 人的AXIN1蛋白能够与TNKS结合导致细胞中的β-catenin升高,非洲象的AXIN1蛋白不能与TNKS结合,可能导致细胞中的β-catenin降低,从而对睾丸下降产生影响. 因此,和人相比较,蛋白互作能力的差异可能也导致非洲象睾丸未下降的一个原因. 人AXIN1的第57位氨基酸位于TNK蛋白质结合区域,表5中的数据表明,非洲象AXIN1不能与TNKS结合,所以非洲象中第57位氨基酸的插入可能是导致AXIN1无法与TNKS结合. AXIN1的第507～712位氨基酸能够与AXAM(axin associating molecule)结合,AXAM能通过下调 β-catenin 的水平来抑制Wnt信号通路[6]. 非洲象AXIN1蛋白质的第513位、第617位、第675～679位在这段区域内存在插入和缺失,可能影响AXAM与AXIN1结合,对β-catenin的水平产生影响,进而导致睾丸下降的表型出现异常,但是关于插入缺失对睾丸下降的影响需要实验进一步研究. 除了插入和缺失之外,在人和非洲象的AXIN1蛋白质序列中还有氨基酸位点存在差异,因为人和非洲象的亲缘关系相距甚远,且实验室前期在睾丸完全未下降和睾丸完全下降的物种中没有发现特异性的氨基酸位点,因此,氨基酸位点的差异是否会对睾丸下降产生影响还需要实验进一步研究.

表5 非洲象AXIN1与其他蛋白质的互作关系信息表Table 5 Information table of interaction between Loxodonta africana AXIN1 and other proteins

生物信息学的分析是对基因功能以及结构等的预测,关于人和非洲象AXIN1基因在睾丸下降中的功能有待于进一步探讨和研究. 接下来将利用分子生物学和细胞生物学相关实验技术研究第9个外显子缺失氨基酸插入缺失,重要的氨基酸位点的差异对睾丸下降中信号通路的影响. 此外,还将利用基因编辑技术在小鼠体内探究AXIN1基因第9个外显子缺失对睾丸下降这一表型的影响.